抗黄矮病小麦新品系的分子标记检测研究[1]
小麦黄矮病是小麦主要病害之一，由蚜虫传播的大麦黄矮病毒（Barley yellow dwarf virus，BYDV）引起，有“黄色瘟疫”之称，世界上许多小麦主产国常因黄矮病而遭受巨大损失。近年来随着干旱、暖冬现象的发生，麦长管蚜、麦二叉蚜越冬基数明显上升，由于其较强的传毒能力，导致小麦黄矮病在部分区域频繁流行，造成小麦减产20%～40%，局部严重地块高达60%以上。小麦近缘种属中的中间偃麦草是小麦黄矮病的重要抗源，许多学者用它育成了抗BYDV 的双二倍体、二体附加系和易位系等抗源材料，现已成为国内外小麦育种的重要种质资源，采用辐射诱变、单倍体育种、转基因技术等也创造了许多抗病新种质。
在BYDV 抗性基因向优良小麦品种的转育过程中，一般通过抗病性鉴定来跟踪抗病基因的遗传性。传统的表型鉴定要经过多年田间自然发病或接毒蚜鉴定，常受到饲毒蚜虫、发病条件、季节和经验等因素的限制，而且在田间一年只能鉴定一次抗病材料，严重制约着抗BYDV 小麦育种的进程。基于PCR 技术的DNA 分子标记，则可克服上述局限，具有操作简便、灵敏、快速，更适于对田间育种群体的早代选择，因此，建立稳定的特异PCR标记非常必要。
本研究应用分子标记技术对近年来以无芒中4 和L1 为抗源育成的品种（系）做了研究，并结合田间黄矮病鉴定分析，辅助筛选到了高抗黄矮病小麦新品系。
1 材料和方法
1.1 材料
植物材料包括天水市农科所以无芒中4（2n=56）为抗源育成的品种（系）中梁22、90304、93646、远中、87300、81995 和张掖市农科所以L1（2n= 44）为抗源育成的品种（系）张春11 号、张春17 号、张春20 号、2003-2、2003-3、2003-4、2003-5 等；黄矮病鉴定以上述材料中的新品系为主，包括2003-2、2003-3、2003-4、2003-5、81995、90304、93646 以及小麦常规品种陇辐2 号、张春20 号。分子标记以无芒中4 为抗性对照，抗病鉴定以无芒中4和定筱4号为抗病对照和感病对照。
1.2 方法
1.2.1 抗病基因的分子标记
小麦DNA 提取采用CTAB 法，PCR 反应体系25 μL，其中包含10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，1.8 mmol/L MgC12，0.2 μmol/L dNTP，0.25 μmol/L 引物，1 U Taq 酶，约30 ng 基因组DNA。反应程序为：94 ℃3 min，35 个循环（94 ℃45 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s），72 ℃延伸8 min。引物的退火温度范围为50～63 ℃，4 ℃反应结束。RAPD 的PCR 反应为45 个循环，退火温度为36 ℃。扩增产物用2%～3%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果用凝胶成像扫描仪拍照并保存。试验中所用生化试剂均为分析纯，引物由大连宝生物技术有限公司合成，DNA Taq 酶和电泳试剂购自上海生工公司。参照文献报道，Xg-wm37和SC-W37标记与抗黄矮病基因紧密连锁，目标片段为450 bp；RAPD 标记OPF15 的扩增产物在880、650和500 bp处出现3条与抗黄矮病基因相关的谱带。
1.2.2 小麦黄矮病抗性鉴定
1.2.2.1 鉴定方法
苗期鉴定试验由甘肃省农科院植保所在甘谷试验站完成，采用了人工接种和自然感病两种方式进行。人工接种在小麦拔节期开始，首先将塑料棚内在燕麦上扩繁的麦二叉蚜、禾谷缢管蚜和麦长管蚜（主要传播黄矮病GAV、GPV株系）从寄主上分离，放入大培养皿盖严，饥饿12 h 后，再将经过大量扩繁的具有大麦黄矮病典型症状的燕麦叶片剪成1～2 cm 的小段，放入大培养皿盖严，饲毒24 h，最后将上述带有蚜虫的病叶用镊子轻轻接到被鉴定的材料和对照材料上，接种时每株确保接种混合蚜虫10 头，之后放入防虫网罩内，在适当的水肥条件下生长。自然感病指在大田条件下自发黄矮病，在试验结束之前不喷药杀虫。
1.2.2.2 病情调查、病害分级及抗性评价标准
病情调查在小麦扬花期和灌浆期进行，对每份材料逐株记载发病情况，并进行群体的病害分级和平均严重度计算。分级标准参照国家农业行业标准《小麦抗病虫性评价技术规范》（NY/T 1443.6-2007）（表1、表2）。抗性评价标准是依据成株期鉴定材料的平均严重度分级来评价其抗性水平，具体评价标准见表2。
表1 小麦黄矮病成株期病害分级标准
表2 小麦成株期对黄矮病的评价标准
计算公式：
，式中：
表示平均严重度；i表示病级数（1～n）；
Xi表示病情为i级的单元数；Si表示病情为i级的严重度值。
2 结果与分析(https://www.daowen.com)
2.1 抗病基因检测
采用RAPD、SSR和SACR 分子标记，对抗病对照无芒中4及各供试材料进行检测，结果如图1～图3 所示。RAPD 标记OPF15 在无芒中4 和大多供试材料中，可扩增出3 条大约880、650 和500 bp 与抗黄矮病基因相关的条带，而春小麦品系2003-4 例外，没有此3 条特异条带。试验经3 次重复，结果稳定。SSR 标记Xg-wm37 的扩增产物中，无芒中4 和93646 有1 条约450 bp 的特异带，2003-2 有1 条约300 bp 的条带，该DNA 片段与抗病基因相关，远中等材料PCR 扩增产物电泳谱带模糊不清，难以分辨。采用由Xg-wm37 转化而来的SACR 标记SC-W37 的扩增产物中，同样除春小麦品系2003-4 无扩增以外，无芒中4和所有检测品种（系）都有450 bp 左右的清晰条带，尤其无芒中4、93646、2003-2、张春17 号、张春20 号和陇辐2 号都出现了强带，则证明了这些材料携带抗黄矮病基因。因此，通过分子标记检测可以确定，春小麦品系2003-4 为感病材料，其余供试材料携带与抗黄矮病相关的基因。
图1 RAPD标记OPF15分子检测
图2 SSR标记Xgwm-37分子检测
图3 SCAR标记SC-W37检测结果
2.2 小麦抗黄矮病鉴定结果
对人工接种和自然感病两种方式下的发病情况做了详细观察，进行了群体病害分级，记录了抗、感病株数，依据平均严重度分级标准对鉴定材料做了抗性评价，结果如表3所示。从中可以看出，与对照无芒中4 相比，9 份供鉴材料在整体上抗病性较强，高抗材料占67%，高抗新品系占56%，说明这些品系对甘肃地区流行的黄矮病株系表现出有效抗性。其中春小麦新品系有2003-2、2003-5和81995表现较好，抗性水平优于常规抗病品种张春20号。冬小麦品系90304、93646均表现为高抗，抗性水平接近对照无芒中4。从人工接种毒蚜和自然感病两种鉴定方式来看，结果高度一致，相同检出率72.7%，但自然感病条件下平均严重度普遍高于人工接种，这与自然生态环境条件有关。
2.3 分子检测与抗病鉴定比较
供试材料在室内分子检测和田间抗病性鉴定中，对于感病和抗病材料的判定结果非常一致，同时确定春小麦品系2003-4 为感病材料，其余的全部为抗病材料，但抗病能力的高低不是分子标记所能检测出来的，还是要通过田间抗病表现来确定。一般分子标记检测灵敏性非常高，它能快速准确地检测到供试材料中抗病基因的有无，甚至能辨别纯合的或杂合的基因型，因此，对育种中的大量早代分离群体采用分子标记进行辅助选择具有常规育种不可比拟的优越性。
表3 鉴定材料成株期黄矮病抗性
3 讨论
在本研究中利用OPF15标记在除2003-4之外的所有材料中检测到了880、650、500 bp的与抗病基因相关的目标片段，3次重复结果稳定一致。Xg-wm37标记引物特异性强，对试验要求非常严格，PCR 扩增效率低，只在无芒中4 和93646 两个材料中有可分辨出的450 bp 目标条带，而由其转化而来的SCAR 标记SG-W37 标记在除2003-4 之外的其他材料中检测到了抗性基因。因此，要更准确、快捷地进行抗病基因的检测和筛选，发掘与抗性基因紧密连锁或共分离的共显性PCR标记尤为必要。
利用分子标记技术从基因型进行抗病基因的检测和筛选，表现出了灵敏、快速、高效等优点，但抗病能力的高低仍要通过常规鉴定才能得以确定，将分子标记技术与常规育种紧密结合，才能更有效地对农作物进行定向改良。
在大田条件下的病害严重度大于人工接种，原因是在土壤、风媒、大量虫媒等综合复因素影响下感染的病毒种类和数量远大于人为控制因素，因此产生的病害更为严重，相应的其鉴定结果更准确。但在育种的早代选择阶段，采用人工接种方式在小范围内进行抗病虫鉴定无疑会提高选择的高效性和加快选择进程。
参考文献（略）
王红梅，张正英，欧巧明，陈玉梁：甘肃省农业科学院生物技术研究所
王浩瀚：甘肃省张掖市农业科学研究所
岳维云：甘肃省天水市农业科学研究所中梁试验站