二、转化方法
1.根癌农杆菌介导的植物遗传转化
常用的根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法有以下三种：
（1）叶盘转化法（leaf dish transformation）
叶盘转化法是1985 年由Horsch 等发展起来的一种经典的基因转化方法，现在在原来方法的基础上改动较大，主要步骤为：
①准备植物受体：用打孔器在消毒或无菌叶片上打孔，将所得圆形叶盘作为农杆菌侵染受体备用。
②侵染菌液制备和侵染：将含有目的基因质粒的农杆菌菌株培养至对数生长期，收集菌液，用1/2MS液体培养基重悬至一定浓度，为侵染菌液。将准备好的叶盘浸泡在侵染菌液中数分钟，取出侵染过的叶盘，吸干菌液，置于共培养基。
③共培养和选择培养：将侵染过的叶盘在黑暗条件共培养至叶盘周围生长有肉眼可见的菌落时结束共培养，将叶盘转移至含有抑菌剂和选择剂的培养基中进行转化体的选择。
④转化体的获得：对在含有抑菌剂和选择剂的培养基上存活且能生根的植株进行PCR等分子检测，检测的阳性植株为转化体。
叶盘转化法适用于所有能从叶子再生植株的各种植物，改良的叶盘转化法是将侵染的外植体从叶片扩大到茎段、叶柄、胚轴、子叶等。其优点是重复性高，操作简单，缺点是依赖高效的叶片或其他外植体的再生体系。
采用叶盘转化法时要注意以下技术要点：
①由于农杆菌难以侵入叶片或其他外植体的深层部位，所以利用该方法时外植体的创伤部位应该含有大量农杆菌转化敏感的分裂细胞。如叶脉的功能细胞常常在深层，所以制备叶盘时要避开叶脉，尤其是主脉。
②叶片、胚轴、茎段等外植体在培养过程中会膨大，造成切口边缘上翘或卷曲，使农杆菌侵染过的切面因接触不到培养基而不能生长实现转化，所以接种时要把叶盘等切口边缘轻埋入培养基，同时叶盘以圆形和近圆形为佳。
（2）整体植株接种共感染法
该方法是模拟农杆菌天然的感染过程，人为地在植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种或注射到创伤部位或植株体内，从而完成T-DNA 的转移，获得转化体。其优点：周期短，充分利用实生苗的生长潜力，转化率较高；缺点：转化组织和非转化组织常形成嵌合体，转化细胞筛选困难。
主要步骤有：
①植物受体：挑选生长良好的无菌实生苗，在植物茎端等生长点部位进行刀切创造伤口，用接种环将含有目的基因的农杆菌接种到伤口，或在茎段等生长点部位穿刺接种含有目的基因的农杆菌。
②选择培养：将接种过农杆菌的植株继续培养，在含有选择剂的培养基中筛选转化体。
③转化体的获得：能持续在含有抑菌剂和选择剂的培养基上存活的植株进行PCR等分子检测，阳性植株为转化体。
（3）真空渗入法
真空渗入法借助于真空装置使外源基因通过农杆菌介导发生转移，它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养即可获得大量转化植株的基因转移方法。(https://www.daowen.com)
主要步骤有：
①侵染菌液制备和侵染：将含有目的基因质粒的农杆菌菌株培养至对数生长期，收集菌液，用1/2MS液体培养基重悬至一定浓度，为侵染菌液。
②植物受体：挑选生长良好的植株，将其部分组织或整体浸入准备好的侵染菌液中，抽真空，使植物和农杆菌菌液处于真空状态。
③转化体筛选：将植株在正常条件下培养至开花结实，收集种子。种子无菌培养于含有选择剂的培养基中筛选抗性植株。抗性植株进行PCR等分子检测，阳性植株为转化体。
2.发根农杆菌介导的植物遗传转化
发根农杆菌寄主比根癌农杆菌广泛，能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物。与根癌农杆菌相比，徐洪伟等（2005）总结了发根农杆菌介导的植物遗传转化具有以下优点：
（1）Ri质粒可以不经“解除武装（disarm）”进行转化，并且转化产生的毛状根能够再生植株；
（2）毛状根是一个单细胞克隆，可以避免嵌合体，并且毛状根每一个细胞都是通过转化而来的，有利于遗传操作；
（3）可直接作为中间载体；
（4）Ri 质粒和Ti 质粒可以配合使用，建立双元载体，拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围；
（5）毛状根适于进行离体培养，而且很多植物的毛状根在离体培养条件下都表现出原植株的所有特征。因此，Ri质粒不仅可以作为转化的优良载体，而且能应用于有价值的次生代谢物的生产。
发根农杆菌基因转化方法有直接接种法和外植体共感染接种法，两者之间并无本质差别，前者发根农杆菌感染的对象一般为无菌幼苗、试管苗等整体植株，后者感染对象是植物的部分组织，如子叶、真叶、胚轴、子叶节、肉质根、块茎及未成熟胚等；前者是将发根农杆菌菌液直接注射到植株的特定部位，后者是将外植体与发根农杆菌在培养基中共培养。
两者转化的基本程序是一致的，主要有以下步骤：（1）发根农杆菌的纯化培养；
（2）被转化植物材料的预培养和切割；
（3）菌株在植物外植体上的接种和共培养；
（4）诱导毛根的分离和培养；
（5）转化体的确认和选择；
（6）转化体毛状根的植株再生培养；
（7）转化体的生物测定和分析。