外源基因表达的qRT-PCR检测
实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称qRT-PCR）技术1996 年推出，其应用包括甲基化检测、目的基因表达量的检测、单核苷酸多态性的测定等分子生物学领域。其原理是在反转录酶的作用下，以待检植株的RNA 为模板合成cDNA，再以cDNA 为模板，在反应体系中加入荧光基团，扩增出特异的产物。利用荧光信号实时检测扩增产物，在反应早期，产生荧光被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，随着反应时间的进行，产生的荧光进入指数期和平台期，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线，在平台期，扩增产物与起始模板量之间没有线性关系，也不能计算起始拷贝数；只有在反应处于指数期，产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段通过标准曲线定量分析从而推断模板最初的含量。因此，不但可在转录水平上检测目的基因是否表达，还可以检测转录出的含量。
在荧光定量PCR 中，应用较多的是采用相对定量去比较多个样本间的某一特定性质。这就需要以参照基因作为标准进行相对定量，即在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因，而且表达水平不受研究条件下处理方式的影响。确定这样的参照基因十分重要，在大多数研究实验中，使用多个参照基因对于准确定量是必需的。
决定qRT-PCR 反应成功与否的几个关键因素如下：
1.模板的质量
模板的质量决定总RNA 的提取、纯化、分装和保存等过程，包括RNA 的浓度、纯度以及降解度。可用有机溶剂酚与氯仿抽提蛋白质和其他细胞组分，用乙醇或异丙醇沉淀RNA，用异硫氰酸胍法防止RNase 降解RNA。
2.底物的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系
底物如保存不当，易变性失去生物学活性，反复冻融会使其降解，应小量分装，-20 ℃冰冻保存。底物浓度要均衡，以免引起错配。(https://www.daowen.com)
3.引物的质量
引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR 反应结果的关键。引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率，同时尽可能减少非特异性扩增产物。
4.酶和Mg2+
酶浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。Mg2+是DNA 聚合酶的辅酶，对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响。同理，Mg2+浓度过高，降低反应的特异性，易出现非特异性扩增：浓度过低会降低Taq 酶的活性，使PCR 产量下降。
5.反应条件的优化
要严格优化反应条件，使目的基因和管家基因同时处于良好的环境下完成定量检测过程。
qRT-PCR 优点是灵敏性好、精确度高、污染小，尤其是可以在样品量较少时达到定量检测基因表达的目的。目前已成为检测基因表达的主流方法。王聪聪（2017）通过qRT-PCR 方法分析了异源表达陆地棉开花基因GhFLP5 使拟南芥提前开花，且转基因株系中成花基因AtAP1 表达量升高达16 倍，生长素应答基因AtSAUR20 和AtSAUR22、赤霉素合成相关基因GA20OX1 的表达也显著上调。秦朋飞等（2016）利用qRT-PCR 分析了不同逆境如盐、旱、低温、高温逆境胁迫诱导下棉花酰基辅酶A 结合蛋白基因GhACBP3 和GhACBP6 在陆地棉高盐、干旱胁迫中的功能，为利用ACBP 基因提高棉花抗逆性提供了重要的理论基础。