转录因子DREB1A基因和Bar基因双价植物表达载体的构建及对马铃薯遗传转化的研究[3]
干旱响应转录因子可以调控一系列耐旱相关基因的表达，是一种更加有效地提高耐旱性的途径。目前研究结果显示，转录因子DREB1A 可以调控40 多个与干旱、高盐和低温胁迫有关的功能基因的表达。因此，以rd29A 启动子驱动DREB1A 转录因子在转基因植物中表达，可以大大减小因基因组成型表达（如植物基因工程中常用的35S启动子驱动下的表达）给转基因植株带来的不利影响，并避免转入单个功能基因作用单一的局限性，对提高植物抗逆性更有优势。
本研究从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆了rd29A 启动子和DREB1A 转录因子，利用DNA 重组技术构建了诱导型启动子rd29A 驱动转录因子DREB1A 基因和CaMV35S 启动子驱动Bar 基因的双价植物表达载体，并通过农杆菌介导法对马铃薯进行遗传转化，获得了转基因植株，为改良马铃薯种质资源和薯类作物的抗逆性奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
植物材料：拟南芥为Columbia 生态型，2010 年10 月在甘肃省农业科学院生物技术研究所培养获得试管苗。马铃薯陇薯10 号为2011 年4 月在甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源和生物技术研究室脱毒扩繁的试管苗。整个试验完成时间为2010 年10 月到2013年8月。菌株和质粒：载体pGEM-T vector和大肠杆菌菌株DH5α购自大连宝生物工程有限公司，其余菌株由本实验室保存。Taq 酶、各种限制性内切酶、氨卞青霉素、卡拉霉素、IPTG、X-gal等试剂均购自TaKaRa 公司；T4DNA 连接酶购自Promega 公司；DNA 回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；其他各种试剂均为国产分析纯。基因测序由赛百盛公司完成。
1.2 拟南芥总基因组DNA的提取和DREB1A基因及rd29A启动子的克隆
分别根据GenBank 中检索到的拟南芥DREB1A 基因序列（genebank ID：AB007787）、rd29A 启动子原序列（genebank ID：D13044），利用PCR 技术从拟南芥基因组中分离DREB1A 基因和rd29A 启动子。通过分子生物学分析软件Oligo 6.0 设计合成了以下4 条引物（北京赛百盛生物技术公司），DREBIA 基因引物，D1：5′-GCG GGA TCCBam H I ATG AAC TCA TTT TCT GCT TTT TC-3′；D2：5′-GCG ACT AGTspe ITTA ATA ACT CCA TAA CGA TAC-3′。rd29A 启动子引物，R1：5′-GCG AAG CTTHind IIIAGT ACTsca IAAC GCA TGA TTT GAT GGA GGA-3′，R2：5′-GCG GGA TCCBam H ICTT TCC AAT AGA AGT AAT CAA ACC-3′。
1.3 NOS终止子序列NOS1和NOS2的亚克隆
根据NOS 终止子序列，通过分子生物学分析软件Oligo 6.0 设计合成了以下4 条引物（北京赛百盛生物技术公司），NOS 序列引物，N1：5′-GCG GGA TCCBam H IGAA TTT CCC CGA TCG T-3′，N2：5′-GCG GAG CTCSac IACT AGTspe IGAA TTC CCG ATC TAG TAA CA-3′；NOS2序列引物，N3：5′-GCG GAA TTCEco R I AAG CTTHind IIIGAA TTT CCC CGA TCG T-3′，N4：5′-GCG CAC AAA GTGDra IIIGAA TTC CCG ATC TAG TAACA-3′。
1.4 中间载体pBI121-rd29A-DR的构建
用SacⅠ和Bam HⅠ酶切植物表达载体pBI121，回收大片段，将回收的大片段与NOS1序列连接，构建成中间载体pBI121-N1，再用SpeⅠ和Bam HⅠ双酶切pBI121-N1，回收大片段，将回收的大片段与基因DREBIA 片段相连接，构建成中间载体pBI121-DR，用HindⅢ和Bam HⅠ双酶切pBI121-DR，回收大片段，将回收的大片段与rd29A 启动子片段相连接，构建成中间载体pBI121-rd29A-DR。
1.5 双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR的构建
用EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切植物表达载体pBI121，回收大片段，将回收的大片段与用同样酶切pAHC25 回收的小片段连接，构建成中间载体pBI121-35S-Bar （图1）。用EcoRⅠ和Dra Ⅲ双酶切pBI121-35S-Bar，回收大片段，将回收的大片段与NOS2序列连接，构建成中间载体pBI l21-35S-N2，用Hind Ⅲ单酶切pBIl21-35S-N2，回收酶切的小片段35S-Bar-NOS，并与用同样酶切pBI121-rd29A-DR 所得的载体大片段相连接，构建成双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR。
图1 pBI121-rd29A-BDR载体
Fig.1 Structure of vector pBI121-rd29A-BDR
1.6 马铃薯的遗传转化及其分子检测
1.6.1 根癌农杆菌转化
载体pBI121-rd29-BDR 向根癌农杆菌LBA4404 的直接转化参照文献。采用液氮冻融法将pBI121-rd29-BDR 质粒导入根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞，涂布在含有50 mg/L 利福平（rif-ampicin，Rif）、50 mg/L 链霉素（streptomycin，Str）和50 mg/L 卡那霉素（kanamycin，Kan）的固体YEB 培养基上培养。挑取单菌落进行PCR 检测，确定质粒导入农杆菌中，获得可用于植物遗传转化研究的工程农杆菌LBA4404 （pBI121-rd29-BDR）。
1.6.2 马铃薯外植体的转化及植株再生
将无菌试管苗切成0.5 cm 长，不带腋芽的茎段，在固体培养基（MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA + 2 mg/L GA3+ 0.5 mg/L 2,4-D）制成的平板上预培养3 d，随后在制备好的农杆菌工程菌中浸泡8 min，其间不断摇动，取出后用无菌滤纸吸干表面的菌液，转入附加羧卞青霉素（carbenicil-lin，Crb）500 mg/L 的固体愈伤组织诱导培养基上，于28 ℃黑暗共培养3 d。暗培养结束后，将茎段转移到附加草丁膦（phosphinothricin，PPT）2 mg/L和Crb 500 mg/L 的相同培养基上，经过抗性愈伤的初步筛选后转接到抗性芽分化筛选培养基进行抗性芽的诱导和筛选，连续光照强度2000 1x，（25±1）℃条件下诱导芽分化。至抗性芽长至1～2 cm 时，将其切下转入附加PPT 2 mg/L 和Crb 浓度逐渐减量的MS 培养基上，进一步进行阳性转化植株的抗性筛选和诱导生根。
1.6.3 转基因植株的PCR检测
参照杨锦芬等的方法，用十六烷基三乙基溴化铵（cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB）法提取转基因马铃薯植株及未转基因马铃薯的叶片总DNA。即在2 mL 离心管中，加入500 μL 的2×CTAB 和20 μL β-巯基乙醇，65 ℃预热，取待检测试管苗植株叶片0.5 g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，混匀后置65 ℃水浴中保温30 min，并不时轻轻转动试管，加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下12000 r/min 离心10 min，移上清液至另一离心管中，向管中加入1/100 体积的RNase A 溶液，37 ℃放置20～30 min，加入2 倍体积的无水乙醇，会出现絮状沉淀，-20 ℃放置30 min后，12000 r/min离心10 min回收DNA沉淀，用70%乙醇清洗沉淀2 次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O 中，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。以此DNA为模板进行PCR检测。
1.6.4 RT-PCR检测
参照郑琳琳等的方法，用30%PEG 模拟干旱条件，对马铃薯胁迫3 d 后分析目的基因的表达情况。马铃薯总RNA的提取使用RNAprep pure Plant Kit （TIANGEN）试剂盒。cDNA 的合成采用First strand cDNA Synthesis Kit （THERMO）试剂盒。以马铃薯actin 基因为内标，其特异引物为A1：5′-GGA GAA AAT CTG GCA TCA TAC AT-3′，A2：5′- GTT GGA AGG TAC TTA AAG AAG CC-3′，扩增片段长度为803 bp。RT-PCR反应体系25 μL：包括10×buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL（5 U/μL），20 mmol/L 上游引物1 μL，20 mmol/L 下游引物1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 补至25 μL。PCR 循环参数：96 ℃预变性5 min 后，95 ℃1 min，53 ℃1 min，72 ℃1.5 min，35 个循环后72 ℃延伸10 min。
2 结果与分析
2.1 DREB1A基因和rd29A启动子的克隆
以拟南芥总基因组DNA 为模板进行PCR 扩增（引物D1、D2），用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，扩增出1 条约700 bp 的条带（图2），其大小与基因DREB1A 的大小相符。将PCR产物连接到pGEM-T easy载体上，然后导入大肠杆菌筛选出阳性克隆并进行测序分析，将测序结果与GenBank中序列比较，结果其同源性达99.69%。
利用PCR 克隆技术在拟南芥总基因组中分离rd29A 启动子，结果显示，扩增出1 条约1000 bp 的特异性条带（图3），回收特异片段并连接到pGEM-T easy 中，然后导入大肠杆菌筛选出阳性克隆并进行测序分析。将测序结果与GenBank 中的rd29A 序列比较，结果其同源性达到99.47%。整个序列与原序列有个别碱基不同，其余完全吻合，并且其作为启动子的各个功能元件齐全。
图2 基因DREB1A的PCR结果
Fig.2 Gene DREB1A fragment amplified by primers D1，D2
M：D2000 标记D2000 marker；1，2：以D1、D2为引物扩增的DREB1A片段Fragment amplified from the template of DREB1A by primers D1and D2.
图3 rd29A启动子的PCR结果
Fig.3 Promoter rd29A fragment amplified by primers R1，R2
M：D2000 标记D2000 marker；1，2：以R1、R2为引物扩增的rd29A启动子片段Fragment amplified from the template of rd29A by primers R1and R2.
2.2 中间载体pBI121-rd29A-DR的构建
2.2.1 载体pBI121-N1的构建及检测
用SacⅠ和BamH Ⅰ酶切植物表达载体pBI121，回收大片段，将回收的大片段与NOS1序列按1∶4混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α中，筛选重组子，并将重组子分别用Hind Ⅲ/SpeⅠ、Hind Ⅲ/SmaⅠ双酶切，分别得到了约1200和900 bp的片段（图4），与预期片段相符，表明pBI121-N1成功构建。
2.2.2 载体pBI121-DR的构建及检测
用SpeⅠ和BamHⅠ双酶切pBI121-N1，回收大片段，将回收的大片段与DREB1A基因片段按1∶4混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α中，筛选重组子，将重组子用Bam HⅠ/SpeⅠ双酶切，以pBI121-DR 质粒DNA 为模板，以D1、D2为引物进行扩增，都得到了约700 bp 的片段（图5），与预期片段相符，表明pBI121-DR成功构建。
2.2.3 载体pBI121-rd29A-DR的构建及检测
用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切载体pBI121-DR，回收大片段，将回收的大片段与rd29A启动子按1∶4 混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α中，筛选重组子，将重组子分别用BamHⅠ/SpeⅠ/Hind Ⅲ/BamHⅠ双酶切，并以pBI121-rd29A-DR 质粒DNA 为模板，以D1、D2、R1、R2为引物进行扩增，都分别得到了约700 bp和1000 bp的片段（图6）。
图4 载体pBI121-N1酶切分析
Fig.4 Restriction analysis of pBI121-N1(https://www.daowen.com)
M：D2000 标记D2000 marker；1：Hind Ⅲ/SpeⅠ双酶切2 号质粒产物Digested result of pBI121-N1 by Hind Ⅲ/SpeⅠ；2：Hind Ⅲ/SmaⅠ双酶切pBI121-N1质粒产物Digested result of pBI121-N1 byHind Ⅲ/SmaⅠ.
图5 载体pBI121-DR鉴定结果
Fig.5 Restriction analysis and PCR detection of pBI121-DR
M：Marker Ⅲ标记Marker Ⅲ；1：Bam H Ⅰ/Spe Ⅰ双酶切pBI121-DR 质粒产物Digested result of pBI121-DR by Bam HⅠ/SpeⅠ；2：以pBI121-DR 质粒DNA 为模板，以D1、D2为引物的扩增产物Fragment amplified from the template of pBI121-DR by primers D1and D2.
图6 载体pBI121-rd29-DR鉴定结果
Fig.6 Restriction analysis and PCR detection of pBI121-rd29-DR
M：Marker Ⅲ标记Marker Ⅲ；1，2：分别为Bam HⅠ/SpeⅠ、Hind Ⅲ/Bam HⅠ双酶切pBI121-rd29-DR质粒产物Digested result of pBI121-rd29-DR respectively by Bam HⅠ/SpeⅠand Hind Ⅲ/Bam HⅠ；3，4：以pBI121-rd29-BDR 质粒DNA 为模板，分别以D1/D2，R1/R2为引物的扩增产物Fragment amplified from the template of pBI121-rd29-BDR respectively by primers D1/D2 and R1/R2.
2.3 双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR的构建
2.3.1 载体pBIl21-35S-Bar的构建及检测
用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切植物表达载体pBI121，回收大片段，将回收的大片段与用同样酶切pAHC25 回收的小片段按1∶4 混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α 中，筛选重组子，分别用Hind Ⅲ/EcoRⅠ、Hind Ⅲ/BamHⅠ双酶切，分别得到了约1800 bp 和900 bp 的片段，与预期片段相符（图7），表明pBI121-35SBar成功构建。
图7 载体pBI121-35S-Bar鉴定结果
Fig.7 Restriction analysis of pBI121-35S-Bar
M：Marker Ⅲ标记Marker Ⅲ；1：Hind Ⅲ/EcoRⅠ双酶切pBI121-35S-Bar 质粒产物Digested result of pBI121-35S-Bar by Hind Ⅲ/EcoRⅠ；2：Hind Ⅲ/BamHⅠ双酶切pBI121-35S-Bar 质粒产物Digested result of pBI121-35S-Bar by Hind Ⅲ/BamHⅠ.
2.3.2 载体pBI121-35S-N2的构建及检测
用EcoRⅠ和Dra Ⅲ双酶切pBI121-35S-Bar，回收大片段，将回收的大片段与NOS 序列按1∶4 混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α 中，筛选重组子，并将重组子用Hind Ⅲ单酶切，得到了约1700 bp 片段（图8），与预期片段相符，表明pBI121-35S-N2成功构建。
图8 载体pBI121-35S-N2鉴定结果
Fig.8 Restriction analysis of pBI121-35S-N2
M：Marker Ⅲ标记Marker Ⅲ；1：Hind Ⅲ单酶切pBI121-35S-N2 质粒的结果Digested result of pBI121-35S-N2 by Hind Ⅲ.
2.3.3 植物表达载体pBI121-rd29-BDR的构建及检测
用Hind Ⅲ单酶切pBI121-35S-N2，回收小片段35S-Bar-Nos，并与用同样酶切pBI121-rd29A-DR 所得的载体大片段按1∶4 混合，加入10 U 的T4DNA 连接酶连接，并将连接产物导入大肠杆菌DH5α 中，筛选重组子，并将重组子用Hind Ⅲ单切，得到了约1700 bp片段（图9），与预期片段相符，表明pBI121-rd29-BDR成功构建。
图9 载体pBI121-rd29-BDR鉴定结果
Fig.9 Restriction analysis of pBI121-rd29-BDR
M：Marker Ⅲ标记Marker Ⅲ；1：Hind Ⅲ单酶切pBI121-rd29-BDR 质粒的结果Digested result of pBI121-rd29-BDR by Hind Ⅲ.
2.4 马铃薯的遗传转化及植株再生
经农杆菌浸染的马铃薯茎段通过共培养、选择培养和生根培养后，PPT 筛选到无菌抗性苗22株，抗性苗诱导过程见图10。
图10 抗性苗诱导过程
Fig.10 Induction of resistant seedlings
A：共培养3 d 的马铃薯茎段Potato stems after 3 d from coculturing with Agrobacterium；B：含2 mg/L PPT 筛选培养基上的抗性愈伤组织Resistant embryogenic calli cultured on selected medium supplemented with 2 mg/L PPT；C：含2 mg/L PPT 筛选培养基上的抗性苗Resistant seedlings regenerated on selected medium supplemented with 2 mg/L PPT；D：含2 mg/L PPT 生根培养基上的抗性苗Resistant plant on root medium with 2 mg/L PPT.
2.5 转基因马铃薯植株的PCR检测
以转录因子DREB1A 基因的特异引物为引物进行PCR 检测，结果阳性对照（质粒pBI121-rd29-BDR）和18 株抗性苗扩增出约700 bp 的片段，而空白对照、阴性对照（未转化马铃薯）和部分转化植株无扩增条带（图11 为部分转化植株的检测结果）。从图11可以看出，以转化植株4、5、6 和8 号的基因组DNA 为模板扩增出了目的基因条带，而7号没有目的条带出现，说明4、5、6 和8 号植株的基因组中有DREB1A 基因的整合，为转基因植株，而7号没有目的基因的整合，为非转基因植株。
图11 以D1/D2为引物的转基因马铃薯的PCR检测
Fig.11 PCR detection of potato transformant
M：D 2000 标记Marker Ⅲ；1：空白对照Amplified by D1/D2of H2O；2：阴性对照Potato non-transformant；3：阳性对照（pBI121-rd29-BDR）Positive control（pBI121-rd29-BDR）；4～8：转化植株以D1/D2为引物扩增结果Amplified by D1/D2of potato transformant
2.6 RT-PCR检测
对部分PCR 阳性植株进行RT-PCR 分析，以未转化的陇薯10 号马铃薯为对照，以马铃薯actin 基因为内参，检测在30%PEG 胁迫3 d 后，DREB1A 基因在转基因植株中的表达情况（图12 所示为部分结果），从图12 可以看出，基因DREB1A 在转基因植株中得到了表达，而在非转基因对照中并没有表达。进一步说明，DREB1A基因已经整合到陇薯10号马铃薯基因组中，并能够在转基因植株中转录表达。
图12 转DREB1A基因植株的RT-PCR检测
Fig.12 RT-PCR detection of potato transformant
1：非转基因植株Non-transgenic plant；2～4：转基因植株Transgenic plants
3 讨论
本研究从与抗旱相关的转录因子DREB1A 入手构建植物表达载体。用诱导型启动子rd29A 取代CaMV35S组成型强启动子，将会使外源基因在植物细胞缺水时大量表达，细胞不缺水时并不表达，这样既可以满足植物分子育种的需要，又可以减少CaMV35S 启动子驱动目的基因在所有组织和所有发育阶段表达造成的植株代谢负担，避免物质和能量的巨大浪费。以Bar 基因替换了抗生素抗性基因，不但克服了抗生素筛选的局限性，而且使转基因马铃薯获得了对除草剂的抗性，使用与抗除草剂基因相配的除草剂，能有效除去杂草，不仅有望解决大田的草荒问题，也可节省大量劳动力。
从试验的结果分析来看，本研究克隆的rd29A 启动子各个功能原件齐全，DREB1A 基因与已注册的序列（gene bank ID：AB007787）基本一致，构建的双价植物表达载体pBI121-rd29-BDR 理论上符合基因表达的要求，可用于农杆菌介导DREB1A 基因在植物中的诱导型表达。农杆菌介导法转化马铃薯的研究中，除草剂PPT筛选到了农艺性状良好的转基因植株，PCR 和RT-PCR 检测证明DREB1A 基因已整合到陇薯10 号马铃薯基因组中，并在转基因植株中转录表达，有望提高转基因马铃薯的抗旱性。目前，作者正在进行转基因马铃薯的抗旱性分析研究。
参考文献（略）
贾小霞，齐恩芳，王一航，文国宏，李建武，马胜，胡新元，龚成文：
甘肃省农业科学院马铃薯研究所
王红梅：甘肃省农业科学院生物技术研究所