辣椒TPS家族成员的鉴定与CaTPS1的表达分析[4]
海藻糖（trehalose）是广泛存在于生物体中由2 个分子葡萄糖组成的非还原性双糖，它不仅能在适宜环境下为生物体的新陈代谢提供和储存能量，也能在生物体处于逆境时（如高寒、高盐、高温和干燥失水等）有效地保护生物膜及蛋白质等生物大分子结构和功能的稳定，对生物体起着不可替代的抗逆保护作用（Crowe et al，1996；Lerbret et al，2005；Alpert，2006；Sundaramurthi et al，2010；Hackel et al，2012）。海藻糖在细菌中有多个合成途径，而在真菌、植物和动物中只有1 个合成途径。在植物体内海藻糖主要经TPS/TPP 途径合成，首先由海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）催化尿苷二磷酸-葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸（trehalose-6-phosphate，T6P），然后再由海藻糖-6-磷酸磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）催化T6P 脱磷酸形成海藻糖（Virgilio et al，1994）。已在许多植物中发现了TPS/TPP 海藻糖合成途径中酶的编码基因，植物基因组中含有大量具有TPS和TPP结构域的基因。
TPS 是T6P 合成途径中的关键酶，TPS 基因的过表达能明显提高作物的非生物胁迫适应性。此外，植物中的TPS 基因都以基因家族的形式存在，且大多数植物TPS 基因家族中，只有TPS1 具有TPS 活性。本试验中利用生物信息学手段分析鉴定了辣椒TPS 家族成员，分析其成员分类、染色体定位、基因结构和模体组成，对CaTPS1 的低温胁迫表达模式进行分析，以期为进一步研究辣椒CaTPS功能及抗逆分了机理提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用辣椒品种为甘肃省农业科学院蔬菜研究所选育的“陇椒3 号”，耐寒性强。辣椒全基因组数据来源于The Pepper Genome Datebase （http：//peppersequence.genomics.cn/）（Qin et al，2015）水稻（Oryza sativa）与拟南芥的TPS基因和蛋白序列分别来源于TIGR（http：//www.rice.plantbiology.mau.edu/）（Ouyang et al，2007）和TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）（Huala et al，2001）。
1.2 辣椒TPS基因家族成员的鉴定
以双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻中已鉴定的所有TPS 基因家族成员cDNA 序列为模板，在The Pepper Genome Datebase 中进行tblastn，获得辣椒TPS 相关基因，进一步利用Pfam 数据库工具进行TPS 结构域验证，获得辣椒所有TPS 基因家族成员，利用DNAMAN 6.0软件，根据与拟南芥TPS基因家族成员的同源性进行系统命名。
1.3 辣椒TPS编码蛋白的系统发育分析
以拟南芥和水稻TPS 亚家族成员蛋白序列为参照，运用BioEdit V7.0.1 软件对辣椒TPS家族蛋白序列进行联配分析，联配结果使用MEGA V5.1，采用邻接法生成TPS的系统进化树，校验参数bootstrap值设置为重复1000次。
1.4 模体（Motif）结构分析
以辣椒TPS 家族成员蛋白序列为参照，通过MEME 网站（meme.nbcr.net/meme/intro.html）进行模体结构分析。MEM 分析时蛋白质序列内部不能存在空位，每个位置上可能出现的字母构成一个位置特异性概率矩阵（PSPM），利用该矩阵判断序列组中可能存在的模体。参数设计时模体基序长度最小为10，最大为100，保守序列发现数最大为6。
1.5 基因结构分析
以辣椒TPS 家族成员基因组序列和编码区序列为参照，通过基因结构预测网站（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行基因结构分析（Hu et al，2015）。网站预测时将基因组序列和编码区序列分别转化为FASTA格式，同时保证同一基因的两种序列一一对应。
1.6 CaTPSl的分离与表达分析
对初花期辣椒苗进8 ℃低温处理，同时以未处理植株为对照。采用植物总RNA快速抽提试剂盒（生工，上海）分别提取经不同时间（0、1、6、12、24 和48 h）处理及未处理的辣椒叶、茎和根RNA，用TIAN Script II cDNA 第一链合成试剂盒（天根，北京）反转录成cDNA。以辣椒参考基因组中鉴定到CaTPS1序列设计合成引物（F：TAGGATCCATGCCGGGGAACAAGTAT；R：GCGTCGACTCATGATGCCCCATT，下画线表示酶切位点），扩增克隆CaTPSl序列，送华大基因科技有限公司（北京）测序。
根据测序结果，设计合成荧光定量PCR 引物（qF：GACGAGACCTCCACCAC；qR：GCCCATCAGACAACGAC），以辣椒Actin（GenBank Accession：GQ339766.1）为内参基因（qAcF：ATTCAGGCTGTTCTTTCC；qAcR：AGCATAACCCTCATAGATAG），分别对经上述不同时间低温处理的叶、茎和根cDNA 进行qRT-PCR 分析。采用2-ΔΔCt法（张丹等，2013）计算相对表达量。
2 结果与分析
2.1 辣椒TPS基因家族成员的鉴定与分类
通过生物信息学分析，从辣椒全基因组中共鉴定得到11 个TPS 家族成员（表1），其中有3 个分布于染色体7 上，有6 个分别分布于染色体1、2、5、8、10 和11 上，另外有2个未能定位。通过NCBI-CDD 和PFAM 工具进行蛋白结构域分析，11 个辣椒TPS 蛋白都含有TPS（Pfam：Glyco-transf-20）和TPP（Pfam: Trehalose-Ppase）两个典型特征结构域，其中CaTPS3 含有1 个TPS 和2 个TPP 结构域。根据与双了叶植物拟南芥相关TPS 蛋白的同源性，将11 个辣椒CaTPS 基因分别命名为CaTPS1～CaTPS11。辣椒11 个CaTPS 基因编码蛋白质长度范围从679个氨基酸（CaTPS3）到929个氨基酸（CaTPS1），分子量从77.17 kD（CaTPS3）到104.71 kD（CaTPS1），等电点从5.38（CaTPS7）到8.71（CaTPS3）。
表1 辣椒TPS 基因家族成员基本信息
Table 1 Basic information of TPS family genes in pepper
2.2 辣椒TPS蛋白的系统发育分析
系统发育分析表明，辣椒11 个TPS 蛋白家族成员分为两大类，参照拟南芥的研究结果，将两类家族命名为Class I和Class II。Class I包含CaTPS1～CaTPS3，其余8个成员都包含在Class II（图1）。辣椒TPS蛋白家族成员进化结果与拟南芥、杨树、大豆和水稻中的分析结果（Lunn et al，2007；Zang et al，2011；Xie et al，2012；谢翎等，2014）基本一致。
(https://www.daowen.com)
图1 辣椒TPS 基因家族编码蛋白CaTPS系统进化树
Fig.1 Phenogenetic tree of TPS in pepper
此外，ClassI 中CaTPS1～CaTPS3 均含有较多的内含子，分别为16、16 和13，Class II中所有成员均含有2 个内含了（图2）。该结果与拟南芥、杨树和水稻中的研究结果吻合（Lunn et al，2007；Zang et al，2011；Xie et al，2012）。以上结果说明植物Class I 和Class II经历了不同的进化方式。
图2 辣椒TPS 家族成员的基因结构
Fig.2 Gene structure of TPS family genes in pepper
2.3 CaTPS基因家族蛋白模体分析
通过模体分析网站MEME对CaTPS基因家族蛋白进行Motif分析，11个成员中共找到6个Motif（Motif 1～Motif 6）（图3）。除CaTPS3 外，其余10 个成员均含有Motif 1～Motif 5，且排列顺序完全一致，Motif 1～Motif 4 定位于TPS 结构域中，而Motif 5 定位于TPP 结构域中。CaTPS3含有1个Motif 4，定位于TPS结构域中，同时含有2个Motif 3，分别定位于其2个TPP 结构域中。除此之外，ClassII 的8个成员中均存在1个特有的Motif 6，紧挨Motif 4，横跨TPS和TPP间区至TPP前端氨基酸，是Motif成员中最长的Motif。
图3 辣椒TPS 基因家族模体及模体分布图
Fig.3 Motifs and their distribution of TPS family in pepper
2.4 CaTPS1的表达分析
根据辣椒基因组数据库（http://peppersequence.genomics.cn/）鉴定得到CaTPS的家族成员cDNA序列，设计引物，成功克隆出CaTPS1（GenBank accession number：KU568375）。测序表明CaTPS1 的cDNA 全长2790 bp，与参考基因组中鉴定到的该基因序列完全一致（图4）。
图4 CaTPS1基因扩增电泳图
Fig.4 Electrophoregram of CaTPS1
1：未经低温处理的叶片；2：低温处理的叶片；M：DNA marker Ⅲ
利用荧光定量PCR 技术，对CaTPS1的组织特异性进行分析，结果表明：CaTPS1在辣椒幼苗根、茎、叶组织中都有表达，在叶片中的表达量最高，是根和茎中的5～6 倍，而根和茎中的表达量基本相同（图5）。
图5 CaTPS1在不同组织中的特异性表达
Fig.5 The expression of CaTPS1 in different tissues
对初花期辣椒植株进行低温（8 ℃）处理，分析CaTPS1 在不同处理时间的表达情况（图6）。对照植株根、茎和叶中的CaTPS1在不同时间点的表达量基本不变，而在低温胁迫下出现了较为明显的变化。低温胁迫下，在叶片中的表达基本上呈先下降再升高的趋势，在48 h 达到最高，相对表达量是0 h 的1.74 倍；而在茎和根中的表达基本呈先上升后下降的变化，分别于12 h 和6 h 在茎和根中的表达量达到最高，分别是0 h 的2.07 倍和2.14 倍；低温处理后在根和茎中的表达高峰出现时间明显早于叶片，说明不同组织中CaTPS1 对低温胁迫的应答时间存在一定差异。
图6 低温处理不同时间CaTPS1在辣椒叶、茎和根中的相对表达量
Fig.6 The expression of CaTPS1 of different treat times with low temperature in different tissues
3 结论
本试验中共鉴定11 个辣椒TPS 基因。辣椒11 个CaTPS 基因中，有3 个（CaTPS1～CaTPS 3）属于Class I，其余8 个属于Class II，辣椒TPS 蛋白家族成员进化结果与拟南芥（Lies et al，2010）、杨树（Lunn et al，2007）、大豆（谢翎等，2014）和水稻（Zang et al，2011）中的分析结果基本一致。此外，Class I 中CaTPS1、CaTPS2 和CaTPS3 均含较多的内含子，分别为16、16和13，而Class II中所有成员均含有2个内含了，该结果也与拟南芥、杨树和水稻中的研究结果吻合，且Class II中的基因比Class I多1个较长模体。
本试验中从辣椒CaTPS1 的组织特异性和低温胁迫应答模式的分析来看，CaTPS1 的表达存在组织特异性，且在不同组织中对低温应答反应的敏感性不同，总体来说，在叶中的表达量最高。
因此，TPS 基因可能是通过调节其他胁迫相关基因的表达，以及提高海藻糖、脯氨酸、可溶性蛋白等渗透调节物质的含量，来增强植物的胁迫耐受性。对辣椒TPS家族成员的全面了解，有利于全面了解CaTPS参与辣椒非生物胁迫应答的代谢机理，同时为利用转CaTPS基因提高辣椒抗逆性奠定基础。
参考文献（略）
魏兵强，张建农：甘肃农业大学园艺学院
魏兵强，王兰兰，张茹，陈灵芝，张少丽：甘肃省农业科学院蔬菜研究所