目的基因的获得

在基因克隆过程中，首先要获得目的基因，才能进行后续的体外重组体构建。从获得目的基因的途径分，目的基因获得有化学合成、聚合酶链式反应等几条途径。

1.化学合成目的基因

化学合成方法是通过化学的方法按照人们的意愿人工合成所需DNA 序列，该方法的一个前提是，所合成的序列是已知的或者相应的蛋白质氨基酸序列已知。该技术主要是依赖DNA 合成仪进行的。化学合成法适合获取较小的基因片段，一般为100～250 bp。对于较大的基因序列，一般采用先分段合成，再经组装产生全长序列（短片段直接连接或较长片段部分重叠后连接），这样既可节约成本，又可以减少合成过程中产生的错误。

化学合成法的优点在于可以任意改造、修饰基因，在基因两端设立接头及宿主偏爱的密码子。但其限制因素也较多，主要有：

（1）价格相对较高，尤其对于较长的DNA序列；(https://www.daowen.com)

（2）合成的基因在表达方面可能存在困难；

（3）容易造成中性突变。

2.聚合酶链式反应获得目的基因

在基因克隆中，如果已知目的基因的DNA 片段，可以通过提取DNA 或mRNA，根据目的基因设计引物，应用普通PCR或RT-PCR 可以直接对目的片段进行扩增并可以在两端添加合适的酶切位点。普通PCR 扩增目的基因是以提取的总DNA 为模板进行扩增获得目的基因，而RT-PCR 需要提取mRNA，mRNA 经反转录为cDNA，再以cDNA 为模板进行PCR 反应。如果要获得未知基因一段序列或其他物种同源基因序列，也可以采用反向PCR或RACE（cDNA末端快速扩增体系）方法获得目的基因。