整合外源基因拷贝数的IPCR检测

IPCR（Inverse PCR，反向PCR），是Triglia 等在普通PCR 基础上设计的一种新方法。反向PCR 与普通PCR 的共同点是都有一个已知序列的DNA 片段，引物都与已知序列的两末端互补。但是普通PCR 两引物的3′端是相对的，而反向PCR 两引物3′端是相互反向的。这样，在DNA 聚合酶的引发下，普通PCR 扩增的是已知序列片段，而反向PCR 扩增的是已知片段旁侧的序列，此旁侧序列可以是未知的。因此可以用于外源基因在植物基因组中整合拷贝数的分析。当多拷贝多位点整合时，扩增产物在凝胶电泳上呈现出多条条带；单拷贝是只有一条带（图4-1）。它要求模板DNA 复杂度小于109 bp，如果高于此值，则不能达到理想的效果。另外，自连接（环化）的效率也是影响反向PCR成功的重要因素。

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图4-1　反向PCR的原理示意图

模板制备、引物设计及PCR 条件优化是反向PCR 的三个重要环节。其技术难点主要在于选择一种在已知片段两侧分别具有酶切位点，而已知片段内部没有这个位点的限制性酶进行酶切。由于通常使用的内切酶在插入序列上有切点而在载体上不合适位置也有切点，因此在酶的选择上有一定困难。大多数有核生物基因组中含大量的中度和高度重复序列，而且在YAC 或Cosmid 中的未知功能序列中时常也会有类似的序列，这样，通过反向PCR 获得的探针类型就有可能与多个基因序列杂交。