转基因植物的遗传稳定性检测
转基因植物新品种的选育要经过试验研究、中间试验、环境释放和生产性试验、获批安全证书等过程,最终才能进入产业化生产。遗传稳定性是各阶段选育的前提,对于转基因植物育种的成功与否具有关键作用。其对于确定和评估转基因植物的实用价值和应用前景具有重要意义。
关于转化外源基因在受体细胞培养、分裂繁殖及分化过程中的稳定性含义包括两个方面,即外源基因在无性培养阶段的稳定性和有性繁殖阶段的遗传稳定性。因此在转基因的当代通过不同水平检测到转基因的存在只是万里长征第一步,还需要将这样的检测延续到下一代,甚至后几代,即转基因植株遗传稳定性的分析,此处探讨的即遗传稳定性。
外源基因在转基因植物中的遗传具有复杂性和多样性的特点,外源基因片段大小、插入位点、拷贝数、受体基因组染色体的结构等都会影响插入基因稳定遗传和表达,甚至同一转化体的不同转基因株系和不同世代间,目的基因的表达也可能具有显著差异。评价外源基因在转基因植物中的遗传稳定性对于转基因植物新品种产业化生产至关重要。因此,研究外源基因在转化体后代中的遗传规律及其稳定性是植物基因工程育种的新兴发展领域。
转基因植物遗传稳定性检测主要考察转基因植物不同世代目的基因整合的稳定性、目的基因表达的稳定性和目标性状表现的稳定性等方面。针对每个方面,都要对转基因植株的后代进行检测,并且至少要持续3 代。通过连续3 代的基因检测结果,确定外源基因在传递过程中的遗传稳定性,并可判断外源基因的遗传规律。
以下为转基因植物安全评价针对遗传稳定性提出的要求:
(1)目的基因整合的稳定性
用Southern 或PCR 手段检测目的基因在转化体中的整合情况,明确目的基因的拷贝数及在后代中的分离情况,需要提供不少于3代的试验数据。(https://www.daowen.com)
(2)目的基因表达的稳定性
用Northern、Real-Time PCR、Western 等手段提供目的基因转化体不同世代在转录盒翻译水平表达的稳定性(包括不同发育阶段和不同器官部位的表达情况),提供不少于3代的试验数据。
(3)目的性状表现的稳定性
用适宜的观察手段,考察目标性状在转化体不同世代的表现情况。
(4)具体要求
①目的基因在基因组的整合情况:采用PCR、Southern 杂交等方法,分析外源插入片段在植物基因组中的整合情况,包括目的基因和标记基因的拷贝数,标记基因、报告基因或其他调控序列删除情况,整合位点等。外源插入片段的全长DNA 序列包括实际插入受体植物基因组的全长DNA序列和插入位点两侧的边界序列。
②外源插入片段的表达情况:转录水平表达采用RT-PCR 或Northern 杂交等方法,分析主要插入序列(如目标基因、标记基因等)的转录表达情况,包括表达的主要组织和器官(如根、茎、叶、种子等)。翻译水平表达采用ELISA 或Western杂交等方法,分析主要插入序列的蛋白质表达,包括表达的主要组织和器官。