显微镜技术的发展
1665年，英国皇家学会的光学仪器修理员罗伯特·胡克（Robert Hooke，1635—1703）制造出了具有很高质量的凸透镜镜头，并制造了一架复式显微镜，弥补了人用肉眼观察事物的不足，也为未来显微镜的发展开创了方向。具体结构如图2-4。胡克首先想到用在两个不同口径的铁皮圆筒里与两片凸透镜组合起来，通过自由滑动的筒体可以对两片透镜的间距进行调节，同时，用支架将筒体固定在一支立杆上，并用圆盘底座支撑，这样筒体与立杆能配合着完成垂直的移动，调节透镜与标本之间的距离，从而可以观察到标本中的观察物被放大。缺点是操作者观察标本时需进行俯视观察，以及由于透镜技术的原因，胡克制造的这架显微镜清晰度和倍率不足。胡克利用这架显微镜首先观察到了结构较大的昆虫的器官。后来，胡克又将显微镜的筒体设计成倾斜的角度，使人们可以坐着使用复式显微镜对标本进行观察。同时，胡克从一块软木（栎树皮）塞上切下一块光滑的薄片，并用改进后的显微镜观察这一“薄片”，能清楚地看到“薄片”标本上都是小孔，并呈现蜂窝状。胡克首次借用拉丁文把这些小孔叫作cellar，意为“囚室”或“小室”，并于1665年发表在第一本显微学著作《显微图集》中，成为历史上首位发现细胞的科学家。
图2-3 胡克与显微镜
图2-4 罗伯特·胡克显微镜设计手稿
图2-5 罗伯特·胡克绘制的细胞手稿(https://www.daowen.com)
与此同时，荷兰的著名科学家列文虎克（Leeuwenhoek），认为罗伯特·胡克在显微镜下看到的是只剩下细胞壁及其围成的腔隙的死细胞，并没有看到完整的活体的细胞，没有看到真正的细胞。于是他利用制备优质透镜的技术认真研究并制作了当时最好的显微镜，并应用这台显微镜观察了液体标本，发现了许多活体的动植物细胞、原生动物细胞以及细菌，他还将这些发现以报告的形式向皇家协会写信。英国皇家协会把他的这些重大发现进行汇编，形成名为Phiosophical Transaction的论文集。由于他所观察到生物包括细菌、精子和红细胞都属游离的活细胞，因此，真正活细胞的发现者应归属于列文虎克。
继罗伯特·胡克对细胞的发现之后，许多科学家争先恐后地投入对细胞的研究中。其中有两个比较有代表性的人物，其一是英国的植物解剖学和生理学家格鲁（Grew，1641—1712），他利用显微镜重点观察了植物的构造，发现植物的细胞与细胞紧贴在一起，称为“柔软组织”，他还曾描绘了有关植物显微镜观察的100多份图谱，并出版了《植物解剖初察》；还有一个是意大利的科学家马尔比基（Malpighi），马尔比基用显微镜详细地观察和记录了动植物的一些微观结构，如细胞壁，且发现植物体是由很多外壁的中空“小囊”构成，囊内充满着黏液性的物质，即细胞质。马尔比基还著有《植物解剖学》一书，分上、下两册，在1675年至1679年间进行了出版，是一部植物解剖学经典著作。其在《植物解剖学》中明确指出：植物体是由许多细胞组成的，这标志着“细胞是植物的结构单元”这一概念已经开始萌芽。此后，马尔比基还对动物的组织及胚胎进行研究；通过用显微镜仔细研究人体的微观结构，发现了肾小球、肾小管、毛细血管网、红细胞等。在此基础上，对细胞观察所获得的资料不断增加，为生命科学的发展积累了较丰富的资料。
为了增强显微镜的适用性，柯贝别尔氏于1725年主要对显微镜的光源进行了改进，换成了反光镜。从此显微镜不论在外形上还是在性能上都有了改进。科学家卡尔佩珀于1744年再次改进了显微镜的外观结构，首次制成了一架由三只脚支撑的座式显微镜，它的外观为现代的光学显微镜制作和发展奠定了基础，可以看作是现代显微镜的先驱。然而，使用这款显微镜观察标本显示的图像边缘容易模糊不清，难以辨认标本的详细结构。为了改进显微镜的像差和色差，荷兰的一些科学家们曾尝试采用不同的玻璃材料，磨制出不同材质的凹透镜和凸透镜，并进行组合观察，以研究像差和色差的微妙变化。到1830年，英国科学家利斯式（Joseph Jackson Lister，1786—1869）提出用两片透镜胶合成一块可起消色差作用的设计理论，透镜间的间距不同，显微镜的相差不同，具有特定间距的透镜组可使球面像差减小，显微镜进一步得到了改进。
图2-6 光学显微镜
图2-7 光学显微镜
19世纪末，德国物理学家阿贝认为，显微镜的应用领域不能只是将物体放大，还需要考虑被放大物象的清晰程度和分辨率。于是，阿贝根据光的衍射来确定显微镜的分辨率，经过多次的研制和试验操作，直到1873年证明了成像镜头“数值孔径”（NA）与物镜的分辨率成正比；并阐明了NA值的大小也代表了物镜集光能力的强弱，即波长越短，光学显微镜的分辨率越好。此外，阿贝还提出因光衍射的限制，显微镜能达到的分辨率是有限的，这也成为当今超分辨率显微镜领域所需突破的理论极限。为了纪念他的这一理论，人们在阿贝纪念碑的球面上刻下了他的分辨率的极限公式（如图2-8），这一极限理论成为后来显微镜发展的理论基础。
图2-8 ErnstAbbe和他的纪念碑上的分辨率极限理论
阿贝加入了德国人卡尔·蔡司（Carl Zeisss）成立的蔡司（Zeiss）显微镜工厂，于1878年研制成油浸物镜，制造出一系列达到理论分辨率的新物镜。后来，该工厂于1861年首次设计出了复合式光学显微镜，并在图林根州工业展示会上荣获了一枚金牌。由于色差的存在，物镜的放大倍数受到了限制。1884年，蔡司、阿贝和玻璃化学家施奥特（Otto Schott）三个人开了一个新公司，在1886年他们逐渐研究出了消除色差的透镜，从而消除了色差的影响。1890年，蔡司公司的保罗·鲁道夫设计了第一个消除像差的透镜，进而开创了蔡司镜头的新纪元。鲁道夫还于1896年开发了双高斯结构的物镜镜头，使各种镜头的像差都得到了改进。
由于显微镜技术的不断改进，生物科学研究在这一时期也取得了突破性的进展。在1831年，英国的植物学家布朗（Robert Brown，1773—1858）利用显微镜对兰科植物的叶表皮细胞进行研究观察，发现了细胞核的存在。紧接着在1838年，德国的植物学家施莱登观察了大量植物材料，其中，详细地对花粉、胚珠和柱头等组织的结构进行了观察，进一步明确了这些组织都是由许多细胞构成的，还观察到这些细胞中都有细胞核结构。由此，施莱登对植物的本质进行了一系列的理论概括，并发表了典型论著《植物发生论》，提出了植物细胞学说，即每个植物体都是细胞的聚集体，细胞是植物体的基本单位。与此同时，施莱登与德国的动物学家施旺分享了植物细胞有着共同形成规律这一思想，施旺对此很感兴趣并大受启发，到1839年，通过对动物细胞的形成机理和个体发育过程进行细致的研究，尤其是对软骨细胞、脊索细胞、植物细胞进一步详细地做了比较，得出结论：动物体也是细胞的聚集体，一切动物的个体发育过程，都是以受精卵为起点的。为此，他发表了研究报告《动植物结构和生长一致性的显微研究》，进一步阐述了动植物基本结构的相似性。紧接着，由施旺和施莱登两人共同提出：一切动植物都是由细胞及其产物构成的，细胞是一切动植物体的基本单位，这就是现在著名的“细胞学说”。这一学说的提出，将植物界和动物界这两大有机界紧密地联系在一起。
根据光的衍射现象，光在遇到极致微小的观察物时不能发生反射，从而导致光学显微镜的分辨能力在理论上存在一个极限，最大放大倍数无法超过1400倍。因而人们在使用光学显微镜进行科学研究时，无法观察比细菌更微小的病毒。为了改进这一问题，科学家们联想到了既属于粒子也属于波的电子，而且电磁的波长比光波的波长要短很多。其中，德国的物理学家汉斯·布希（Hans Busch，1884—1973）第一个证明了磁场可以以类似于玻璃透镜聚焦可见光的方式聚焦电子束。因此，实验者认为光束可以被电子代替，从而提高图像的分辨能力，这一理论为后续电子显微镜的研制奠定了基础。
1924年，法国的物理学家路易·维克多·德布罗意（Louis Victor de Broglie，1892—1987）作为量子力学的奠基人之一，提出了波粒二象性的假说，并发现电子在6万伏高压加速条件下，可以形成电子束，提高电磁的有效波长，这样在成像时可以显著提高分辨率。1926年，德国科学家汉斯·布什以德布罗意理论进行了研制，设想出了电子显微镜，创立了电子透镜理论，从而研制了第一个磁力电子透镜。
1931年，德国的物理学家兼工程师恩斯特·鲁斯卡（Ernst Ruska，1906—1988）研制了世界上第一台透视电子显微镜，并因此在1986年获得了诺贝尔物理学奖。然而这台电子显微镜仅有5倍左右的放大倍数，并没有突破当时所能观察到的最小物体，与当时的普通光学显微镜相比并不具有优势。为了使电子束的波长更短，从而提高电子显微镜的放大倍数，德国的科诺尔和鲁斯卡于1932年研制出可以将电子束的速度加快到几万倍的电子加速器，并将其装备在电子显微镜上。到1935年，电子显微镜正式投入科学界的应用。
图2-9 电子显微镜
与此同时，为了能更好地观察活细胞和未染色的生物标本，于1935年，荷兰的科学家卓尼柯（Zernicke）发明了相差显微镜，相位差是在光波通过时，因为细胞的部分细微结构的折射率和厚度不同，导致细胞的相位发生变化形成的，这种相位差用肉眼无法观察。而相差显微镜就是利用光的衍射和干涉原理，把相位差变换为振幅差，能更清晰地观察活细胞和未染色的标本。在结构设计上，相差显微镜的物镜部分是带相板的，光源为环状光束，并带有一个可合轴的望远镜（如图2-10、图2-11）。
图2-10 相差显微镜
图2-11 微分干涉差显微镜
随着显微镜技术的不断提高，科学界对微观世界的研究不断深入。德国植物学家耐格里以多种植物生长点为研究对象，用显微镜细致地观察了这些生长点上新细胞的形成，进一步发现新细胞的产生是细胞分裂的结果。而到19世纪30年代，部分研究者逐渐在植物细胞内分辨出液泡，甚至还观察到了细胞壁以及细胞膜的存在。随后又陆续发现了细胞内有叶绿体、造粉体、白色体等各种质体。1857年，寇利克（Kolliker）用显微镜发现了肌肉细胞中的颗粒状结构，并于1897年被德国科学家卡尔·本达（Carle Benda）正式命名为线粒体。于1858年，德国细胞病理学家魏尔肖以前人的研究成果为基础，出版了《细胞病理学》，并提出“所有的细胞都来源于先前存在的细胞”，总结了细胞分裂存在普遍性，即“细胞通过分裂产生新细胞”，指出细胞只能从细胞产生，所有的疾病包括肿瘤在内，都是细胞的疾病，而肿瘤的发生常与慢性刺激有关。1882年，科赫（Koch）在观察微生物标本时，利用苯胺染料对标本进行染色，从而发现了霍乱弧菌和结核杆菌。而1898年，高尔基（Golgi）用硝酸银对细胞染色观察（镀银法），首次在神经细胞中观察到了高尔基体，而这一结构的证实离不开电子显微镜技术的应用和超薄切片技术的发展，高尔基成为首位发现细胞中的高尔基体的显微学家。随后，科学家进一步发现动物生殖细胞和高等植物生殖细胞中染色体的分裂现象。
1938年，德国的阿登纳（M.Von Ardenne）成功开发出第一部扫描式电子显微镜（SEM），通过光束与物质间的相互作用，可以更多地检测到光学显微镜中难以分辨的病原体。之后的几十年间，透射电子显微镜的加速电压越来越高，可透视的物质也越来越厚，最终电子显微镜的放大倍数达到30万倍及以上，达到可以分辨原子的能力。
图2-12 扫描式电子显微镜
诺马斯基（Nomarski）于1952年以相差显微镜为原形创作了能显示三维立体影像结构的微分干涉差显微镜（DIC显微镜），研究者们采用DIC显微镜对无色透明的标本进行观察，能够使标本图像呈现出明显的立体感，当观察的生物标本略厚时，可以增大不同细节的折射率之间的差别，使所观察到的影像实际立体感更明显。
我国的首台电子显微镜是1965年成功试制的，最初的放大倍数仅有20万倍，经过后续的不懈努力，又研制出了可放大80万倍的电子显微镜。到1980年已经研制出能够观察含水的样本的扫描电子显微镜。
图2-13 超高真空STM系统示意图
1982年，国际上的商业机器公司（IBM）苏黎世实验室的罗尔、宾尼格及他们的部分同事共同设计并研制出世界上第一台扫描隧道显微镜（STM）。扫描隧道显微镜的设计依据是量子的“隧道效应”。隧道扫描显微镜在设计上没有镜头，主要依靠一根探针工作，探测器带动针尖在样品表面移动，从而对选中的样品区域进行扫描。具体原理是在探针和物体之间加上电压，电压在电子穿过物体与探针之间的空隙时，会形成一股非常微弱的电流，数据处理系统检测针尖和样品间的隧穿电流强度，随着探针与物体的距离发生变化，这股电流也会有相应的改变，同时这种变化会形成信号输入计算机，最终通过测量电流就可以绘制出样品表面的形体轮廓。扫描隧道显微镜的研制，第一次使人类能够清楚地观察到排列在物质表面的原子状态，在20世纪80年代成为国际公认的十大科学技术之一。为此，在1986年宾尼格和罗尔共同获得了诺贝尔物理学奖。
20世纪后半段，随着计算机水平的飞速发展，电脑技术与电子显微镜技术相结合，被越来越多地用于分析标本的图像，以及对透镜系统的控制，电脑技术的渗入使电子显微镜的操作越来越简单，这个阶段成为电子显微镜发展的黄金期。随着电子显微镜技术的不断进步，美国的细胞生物学家帕拉德（George E.Palade）借助电子显微镜在1995年发现了核糖体，使人们对细胞功能的认识迈出了重大的一步，因此帕拉德于1974年被授予诺贝尔医学奖。
2017年，美国的弗兰克、英国的亨德森、瑞士的杜波切特共同获得了诺贝尔化学奖，因为他们对科学界的主要贡献是共同提出了冷冻电子显微镜技术。此项技术的核心内容是“急速冷冻”，即用液态的乙烷、液氮等物质将含有水分的样品快速冷冻，用于观察一些生物大分子的结构。例如，使用冷冻电子显微镜技术观察蛋白质的结构，能够使水溶液环境中的蛋白质迅速从溶液态转变为玻璃态（玻璃化冷冻），使蛋白质的结构最大限度地维持天然状态，进而有利于在显微镜下捕捉到蛋白质的位置和结构。冷冻电镜技术的研制，使人类在观察标本时拥有了原子级的极限分辨率，可以很好地观察生物大分子的生理状态，在解析物质的结构方面，尤其是研究针对疾病的药物方面作用颇大，从而为人类在观测生物体的微观结构方面提供了有利的技术支持。
图2-14
图2-15 冷冻电镜标本制备
人类文明进程中的伟大发明——显微镜，如今活跃在经济建设、国防、科研、医疗卫生、刑侦等各个应用领域，继续为人类揭示微观世界奥秘做出贡献。时至今日，新型显微镜层出不穷，显微镜的种类和用途越来越细致多样。电子显微镜的分辨能力也早已远胜光学显微镜，使人们的研究向微观世界不断深入，但电子显微镜的使用需要在真空条件下，因此很难观察到活的生物，同时电子束照射会损伤生物样品。所以，即使电子显微镜分辨率更高，但光学显微镜的作用仍然不是电子显微镜能够替代的。