1 巩固
恐惧记忆巩固的过程
记忆在学习或者训练后不会立即保存在大脑中，它需要一个逐渐稳定的过程，即记忆巩固。记忆巩固是保证记忆（包括条件化恐惧记忆）在脑内储存并长时间持续存在的关键阶段。在恐惧记忆巩固过程中，我们的大脑中会进行一系列神经生物学的改变。此时，恐惧记忆还处于不太稳定的状态，若利用行为、药物或其他操作手段干扰恐惧记忆巩固过程，就会使得巩固无法完成，导致恐惧记忆难以获得长期储存（Johansen et al.， 2011）。但随着条件化恐惧训练后时间的推移，巩固过程逐渐进行，恐惧记忆也将逐渐变得更加稳定、难以被干扰或破坏（Myers & Davis， 2002）。因此可以推测，恐惧记忆的巩固过程有关键的时间窗。
在记忆巩固的一系列神经生物学机制上，长时程增强效应（Long⁃term Potentiation， LTP）是学习与记忆的主要细胞机制之一。LTP可分为不同的时程阶段（Milner et al.， 1998）：持续几分钟的短时LTP（Short⁃term LTP，S⁃LTP），由单一高频率刺激引起，不依赖于新蛋白的合成，可能对已存在的蛋白起到修饰作用；长时LTP（Long⁃term LTP， L⁃LTP），由多重高频率刺激诱导，可持续数分钟到数小时，依赖于新蛋白的合成（Y. Y. Huang et al.， 1994； Nguyen & Kandel， 1996）。L⁃LTP与突触的结构性改变有关，而S⁃LTP没有发现突触结构性的改变（Milner et al.， 1998）。长时记忆的形成与L⁃LTP相似，也依赖于新蛋白的合成。利用蛋白合成抑制剂干扰恐惧记忆的巩固过程，动物的抑制性回避行为就难以表达（Tronel et al.， 2005）。因此，从L⁃LTP与S⁃LTP的特征上看，二者很可能分别是参与短时记忆（Short⁃term Memory，STM）与长时记忆（Long⁃term Memory，LTM）的重要细胞机制。
条件化恐惧的短时记忆一般是在条件化恐惧训练后1—4小时进行测试，而长时记忆一般是在训练后的24—72小时进行测试。在条件化恐惧训练后立即给予蛋白合成抑制剂不会影响训练后1—4小时的恐惧行为，也证明短时记忆是不依赖于新蛋白的合成。因此，研究者认为恐惧记忆巩固的时间窗限于条件化恐惧训练后最初的几个小时（McGaugh， 2015），一般不超过6小时，这是干预恐惧记忆的关键时刻。研究也证明，在条件化恐惧训练后直接在海马（Hippocampus）内注入能够干预记忆巩固的药物，会以一种时间依赖的方式调节恐惧记忆的巩固（de Oliveira Alvares et al.， 2008； Lunardi et al.， 2018），提示恐惧记忆确实存在巩固窗口期。这也说明，人类遭受严重的创伤性事件后，也可能存在这样一个关键的干预时间窗。
当然，恐惧记忆巩固的时间窗并不总是固定在6个小时内，它的时间过程会受到特定的学习参数的影响。在条件化恐惧训练时，若给予动物施加的足底电击较强，恐惧记忆的巩固会在6小时内完成；若施加的足底电击较弱，则在训练6小时后给予药物干预仍能破坏恐惧记忆的表达。说明在较弱的应激下，应激6小时后恐惧记忆的巩固仍在继续（Casagrande et al.， 2018）。当然，应激过程中的其他环境条件也会影响恐惧记忆巩固的动态进程。
突触巩固与系统巩固
条件化恐惧记忆的巩固还可以分为突触巩固（Synaptic Consolidation）与系统巩固（System Consolidation）。突触巩固指条件化恐惧记忆获得后几分钟到几小时所经历的巩固过程（Schafe et al.， 2001），类同于L⁃LTP阶段；而系统巩固持续时间较长，指持续几天甚至几星期的巩固过程，此过程将记忆痕迹在多个脑区间进行一次新的系统重组，可使记忆终生保存（Katche et al.， 2013）。在目前的研究中，研究者一般认为记忆获得后约7天是系统巩固的关键时间窗（Dudai， 2004）。Cohen实验室对动物的恐惧记忆与人类PTSD的发病过程在时程上的改变进行了对比研究，也认同应激后7天是恐惧记忆巩固的一个非常关键的时期。对于人类而言，创伤性事件发生后个体的应激反应症状会随着时间的变化而减少，半年后只有约25%的创伤受害者会发展为PTSD。动物在天敌应激训练7天后，同样也有约25%的动物继续表现出显著的恐惧反应，且这部分动物的焦虑与恐惧反应会继续长久保持，与人类的PTSD发病过程相似（H. Cohen & Zohar， 2004）。可见，这与传统记忆巩固理论不同。
记忆系统巩固理论认为，记忆的完整巩固过程为：首先在海马内进行突触巩固，然后记忆信息再缓慢向皮层重组进行系统巩固，最终实现记忆的永久储存（McClelland， 2013； Tse et al.， 2007）。在这个由易被干扰或被破坏的近程恐惧记忆（Recent Fear Memory）到稳定难以干扰的远程恐惧记忆（Remote Fear Memory）的转换过程中，恐惧记忆在行为特征、相关分子机制及相关脑区的神经元形态均发生了显著的变化（Gräff et al.， 2014； Vetere et al.， 2011）。在系统巩固期间，若长时间抑制海马或新皮层的神经活动，就会破坏记忆的形成（Blum et al.， 2006； Nakashiba et al.， 2009）。条件化恐惧获得后立即损毁海马不但能够阻断前扣带皮层（Anterior Cingulate Cortex，ACC）树突棘密度的可塑性变化，还能够破坏36天后远程场景恐惧记忆的表达（Restivo et al.， 2009），说明海马在影响恐惧记忆的远程行为表达与相应神经生物学改变中具有重要的作用。(https://www.daowen.com)
根据经典的系统巩固理论，海马只在记忆形成之初起到支撑记忆巩固的作用（Maviel et al.， 2004； Varela et al.， 2016），而随着记忆的成熟，记忆就开始转向依赖于皮层区域（Frankland & Bontempi， 2005），即海马与皮层在记忆形成后的不同时间发挥着相应的作用。但是，高级皮层区并不只是参与了恐惧记忆的系统巩固。破坏ACC区域NMDA受体的功能，也能够阻断近程恐惧记忆的表达（Zhao et al.， 2005），提示皮层区域也可能参与了恐惧记忆的突触巩固。另外，利用光遗传学技术在记忆获得数周后抑制海马的活动能够破坏远程恐惧记忆的表达（Goshen et al.， 2011），而记忆获得后立即抑制前额叶皮层的神经元活动也能够破坏远程恐惧记忆的表达（Kitamura et al.， 2017）。说明在恐惧记忆形成的早期，海马与皮层区域均可能参与了记忆的巩固过程。这些研究结果无法用经典的系统巩固理论进行解释，那么，恐惧记忆习得后，其巩固的过程到底是怎样的？各个神经环路之间是如何协同工作的？这些问题我们仍知之甚少。
目前我们还无法完全理解恐惧记忆长期储存的动态过程。比如，LTP在记忆形成之初具有重要作用，但其在远程记忆存储中的作用还不清楚（Honoré et al.， 2021）。在记忆环路上，研究者已经发现经典的从海马依赖向皮层依赖的记忆巩固过程已不能解释最新的研究结果，海马与皮层可能在记忆形成之初就参与了记忆巩固的过程，且可能影响远程记忆的表达。因此，有研究者提出了记忆多重痕迹理论（Multiple Trace Theory，MTT）（Barry & Maguire， 2019）。此理论认为，海马、皮层在记忆形成之初存在双向的相互作用，记忆痕迹在最初形成时就存在于海马、皮层等多个神经网络中，且海马的作用也不会随着记忆的成熟而衰退。
到目前为止，已有的研究大多数仍局限于近程记忆向远程记忆转换时海马向皮层的单向转换，我们缺乏对记忆形成后海马与皮层之间的连接是否存在相互的双向作用的研究，我们仍不知道系统巩固的动态神经生物学特征是怎样的。因此，恐惧记忆形成后由近程向远程记忆转换的神经环路、细胞机制及分子机制的动态过程仍有待深入探索。
记忆印迹在恐惧记忆巩固过程中的动态变化
记忆印迹（Memory Engram）的概念在100多年前由德国科学家Richard Semon提出。他认为记忆印迹是由外界刺激引起的脑内生理学的持久改变。由于受到研究条件的限制，他并未指出这种改变的生物学基础是什么。结合最新的对记忆相关分子生物学研究的成果，研究者对记忆印迹有了更深的认识：记忆印迹可以用印迹细胞（Engram Cells）进行标记（Tonegawa， Liu， et al.， 2015）。印迹细胞指一群能够在学习时被激活的神经元，这群神经元在学习后能够产生持久的神经生物学改变，且能够在记忆提取时再次被激活。多个印迹细胞可以在学习后形成印迹细胞通路共同支撑记忆的形成与储存。实际上，早期研究者已经通过脑损毁、电生理或脑功能成像技术探索了不同记忆类型所依赖的脑区域，但这类研究无法深入到对记忆的神经细胞层次的探索，也就无从知道恐惧记忆的印迹细胞到底是什么。
随着可控性即刻早期基因（Immediate Early Genes，IEG）、转基因动物、光遗传学技术、病毒载体介导的药理学及基因控制技术等新技术的进步，目前研究者已经可以实现对记忆印迹细胞的可视化操作（Eichenbaum， 2017； Sweis et al.， 2021； Tonegawa， Pignatelli， et al.， 2015）。然而，已有对记忆印迹细胞的研究主要关注近程记忆高度依赖的海马区域，只有极少数研究探索了远程记忆印迹的表达。如Tayler等利用TetTag双转基因小鼠（H2B⁃GFP TetTag小鼠）在条件化恐惧获得时对记忆印迹细胞进行组蛋白H2B⁃GFP标记，这种标记过程由IEG c⁃Fos启动子所驱动。他们发现，获得2天的恐惧记忆会导致海马、杏仁核与皮层等广泛区域均被H2B⁃GFP标记，但获得14天的恐惧记忆只能够引起H2B⁃GFP标记在皮层区域（Tayler et al.， 2013）。Denny等（2014）利用ArcCreERT2转基因小鼠也研究了获得5天的近程恐惧记忆与获得30天的远程恐惧记忆所诱导的记忆印迹特征。他们发现近程恐惧记忆会使海马部位有丰富的记忆印迹标记，而远程恐惧记忆却无法使Arc⁃EYFP标记在海马部位。从这两项记忆印迹的相关研究看，似乎海马并不参与远程恐惧记忆的形成。但是，有研究者利用光遗传学及神经元钙成像技术，发现在恐惧记忆获得之初，海马与杏仁核到前额叶皮层的神经投射就会被激活，这种神经连接会迅速激活前额叶皮层的记忆印迹细胞。同时，海马与杏仁核内的记忆印迹细胞也被外界应激刺激所激活。随着条件化恐惧训练结束后时间的推移，前额叶皮层记忆印迹细胞在海马的支持下功能逐渐成熟；相反，海马内的记忆印迹细胞则逐渐沉默（Kitamura et al.， 2017）。
由于对记忆印迹的研究起步较晚，且多数研究仍关注近程记忆在海马部位的标记，对远程恐惧记忆形成及保持机制的研究还相当缺乏。我们可以看出，对记忆印迹的可视化标记技术的出现为研究远程恐惧记忆形成的动态过程提供了可行的途径。