一、实验研究
（一）实验目的
通过动物实验研究，观察和验证补肾活血通络法为治则组成的糖络通胶囊对防治糖尿病肾病的疗效并探讨其作用机制。
（二）实验材料
1.实验动物 健康Wistar大鼠，雄性，体重200±25 g，由山东大学实验动物中心提供。标准饲料喂养，室温20～25℃，湿度50%～65%，每日光照正常，空气流通，自由摄食、饮水。
2.糖络通组成 西洋参6 g，生地黄15 g，淮山药15 g，山萸肉12 g，牡丹皮9 g，枸杞子12 g，女贞子15 g，菟丝子12 g，肉苁蓉9 g，当归15 g，益母草15 g，鬼箭羽12 g，三七粉3 g。
将上药浓缩成含生药2 g/mL备用。由山东中医药大学附属医院药剂科提供。
精蛋白锌胰岛素：江苏万邦制药有限公司。国药准字H20050783。
3.仪器与试剂 链脲佐菌素（STZ）：美国Sigma化学制剂公司提供。临用时以PH4.2的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制成2%的STZ溶液。戊巴比妥钠：临用配成0.9%戊巴比妥钠溶液。糖化血红蛋白测定药盒：采用拜耳DCA2000糖基化血红蛋白测定药剂盒。强生稳步血糖仪（美国强生公司生产），OLYMPUSAU2700全自动血生化仪，台式低温高速离心机，721分光光度仪（上海分析仪器厂），电热恒温水浴箱。
（三）实验方法
1.动物分组 随机将Wistar大鼠分为3组，正常对照组（N）11只，糖尿病对照组（D）11只，糖尿病糖络通治疗组（DT）11只。
2.造模方法 适应性喂养1周后，糖尿病大鼠禁食不禁水12小时，按65 mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素（STZ，购自Sigma公司，溶解于0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液中PH4.5），依据72小时尾静脉采血测血糖≥16.7 mol/L者，确定模型建立并纳入本实验。自注射后第三天起D组与DT组均用长效胰岛素2 U隔日皮下注射。
3.给药剂量 DT组按成人剂量的25倍灌服糖络通2.5 g/kg·d，N组、D组灌以等量生理盐水，灌胃容量10 mL/kg，连续给药8周。
4.标本采集 各组大鼠喂养8周后，于代谢笼中收集24 h尿，离心，于-30℃冰箱保存待查。禁食8 h，测尾静脉血糖后，以0.9%戊巴比妥钠按0.2 mL/100 g对大鼠进行腹腔麻醉，解剖腹部，暴露腹主动脉进行取血；取左肾甲醛固定后送病理，部分做电镜，取右肾微分离肾皮质，立即置于液氮中，用于做RT-PCR。
5.检测指标
（1）一般生化指标：体重，空腹血糖，糖化血红蛋白，24 h尿微量白蛋白定量，肝、肾功能。
（2）病理检查：大鼠左肾固定后送山东中医药大学附院病理科以石蜡包埋，切片，HE染色后400倍光镜观察。3组各取一份1 mm3大小肾组织固定后送山东省医科院电镜室透射电镜观察。
（3）肾皮质RAGEmRNA的半定量RT-PCR检测，由山东省医科院完成，具体步骤如下。
1）内参照GAPDH引物序列：forward：5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′，reverse：5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATGGT-3′product 470 bp；引物序列RAGE-forward：5′-ACTACCGAGTCCGAGTCTACCA-3′RAGE-reverse：5′-GCTCTGACCGAAGCGTGA-3′product240 bp。
2）总RNA提取：取100 mg组织，加入1 mLTRIZOL试剂，以高速匀浆机制备组织匀浆后以4℃12 000 g离心15分钟，加入氯仿，每1 mLTRIZOL加入0.2 mL氯仿，VORTEX 15秒，混匀。室温2～3分钟，4℃12 000 g离心15分钟后将最上层水相以每1 mLTRIZOL试剂中加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟，4℃12 000 g离心10分钟，弃上清，每管加入以无RNAase水配置的75%乙醇1 mL，短暂VORTEX，4℃9 000 g离心5分钟。弃上清，室温晾干10分钟。每管加入适量的无RNAase水，4℃溶解30分钟。以eppendorf Biophotometer RNA模式测定RNA浓度及纯度。得到总RNA用于RT-PCR反应。
3）两步法RT-PCR反应检测Fractalkin mRNA表达：
①反转录反应：反应体系如下：5×AMV Buffer 2.0μL，RNAase Free H2O 4.5μL，dNTP Mixture 1.0μL，RNAase Inhibotor 0.5μL，AMV Reverse transcriptase 0.5μL，Oligo dT（18）0.5μL，总RNA（≤1μg）1.0μL，总体积为10μL。混匀后以42℃反应1 h，后99℃反应5 min，5℃反应5 min得到逆转录产物。
②PCR反应：PCR反应体系：10×PCR Buffer 2μL，MgCl2 1.5μL，GAPDH F（4μM）0.4μL，GAPDH R（4μM）0.4μL，RAGE F（20μM）0.4μL，RAGE R（20μM）0.4μL，rTaq 0.2μL，H2O 10.9μL，总体积20μL。混匀，分成16μL，每管加入逆转录产物4μL，按下列程序PCR反应：95℃变性3 min，然后以95℃变性30 s、60℃变性40 s、72℃变性1 min为1个循环，共计32个循环，终末以72℃延伸5 min。(https://www.daowen.com)
4）电泳及半定量检测：1.5%琼脂糖凝胶电泳，Alpha Innotech imager观察电泳条带存入图像，GAPDH的产物为470 bp，RAGE的产物为240 bp。以系统的SPOT DENSITY软件分别测量内参照和RAGE基因扩增条带的密度，以RAGE条带的密度与内参照管家基因的密度比值（OD值）代表基因表达的相对水平。
（四）统计分析
采用SAS统计软件包进行数据分析，采用单因素方差分析。所有计量资料均用
表示。
（五）实验结果
1.对大鼠体重、空腹血糖、糖化血红蛋白的影响（见表15） 与正常对照组相比，糖尿病对照组、糖尿病糖络通治疗组在大鼠体重、空腹血糖、糖化血红蛋白方面无明显差异（P>0.05），说明糖尿病对照组、糖尿病糖络通治疗组血糖控制理想。
表15 对大鼠体重、空腹血糖、糖化血红蛋白的影响
注：经统计学分析，三组无显著性差异（P>0.05）。
2.对大鼠24 h尿微量白蛋白定量的影响（见表16） 与正常对照组相比，糖尿病对照组大鼠24 h尿微量白蛋白定量有显著性差异（P<0.01），糖尿病糖络通治疗组无显著性差异（P>0.05），说明糖络通具有消除蛋白尿的作用。
表16 对大鼠24 h尿微量白蛋白定量的影响
注：经统计学分析，与正常对照组相比∗P<0.01，∗∗P>0.05。
3.对大鼠肝肾功能的影响（见表17） 与正常对照组相比，糖尿病对照组、糖尿病糖络通治疗组在肝肾功能方面无明显差异（P>0.05），说明糖络通对肝肾无不良反应。
表17 对大鼠肝肾功的影响
注：经统计学分析，三组无显著性差异（P>0.05）。
4.对大鼠肾皮质RAGE mRNA表达的影响（见表18） 与正常对照组相比，糖尿病对照组大鼠肾皮质RAGE mRNA（OD值）有显著性差异（P<0.01），糖尿病糖络通治疗组无显著性差异（P>0.05），说明糖络通具有降低大鼠肾皮质RAGEmRNA表达水平的作用。
表18 对大鼠肾皮质RAGEmRNA表达的影响
注：经统计学分析，与正常对照组相比∗P<0.01，∗∗P>0.05。
5.光镜下病理结果 HE染色可见正常对照组大鼠组织结构正常；糖尿病对照组大鼠肾小球系膜细胞和系膜基质轻度弥漫性增生，部分肾小球表现为系膜细胞和基质局灶性增生；糖尿病糖络通治疗组肾小球系膜细胞和系膜基质增生不明显。
6.透射电镜结果 正常对照组大鼠肾小球结构正常，糖尿病大鼠肾小球足突排列紊乱、融合，基底膜轻度增厚，内皮细胞线粒体空泡化，上皮细胞细胞核核膜轻度肿胀、界限不清、内质网肿胀。糖尿病糖络通治疗组肾小球足突规整，基底膜增厚不明显，内皮细胞、上皮细胞无明显改变。