SARS-CoV-2核酸检测
确诊为SARS-CoV-2感染，需要具备两种病原学证据之一：①RT-PCR检测SARSCoV-2核酸阳性；②病毒基因测序与已知的SARS-CoV-2高度同源。现仅介绍实验室常用的RT-PCR法，包括咽拭子样本采集和处理、SARS-CoV-2核酸RT-PCR检测。
（一）咽拭子样本采集和处理
SARS-CoV-2核酸检测常用的样本类型包括上呼吸道样本（咽拭子、鼻咽拭子、鼻咽抽取物）、下呼吸道样本（深咳痰液、肺泡灌洗液）、血液、粪便、尿液和结膜分泌物等。下呼吸道样本检出SARS-CoV-2核酸阳性率更高。咽拭子具有取样简单、无创等优点，因此通常采集患者咽拭子进行SARS-CoV-2核酸检测。
1.咽拭子样本采集。咽拭子样本由护士或医生在负压隔离病房内采集。若隔离病房为非负压，则应具备以下条件：①单人单间；②空气流通；③有空气消毒设备。一般采用压舌板、咽拭子自口咽部或鼻咽部进行采集，将拭子头浸入含病毒保存液的采集管内。
2.咽拭子样本病毒灭活。在固定处理样本处将样本置于56℃水浴箱灭活35分钟。病毒灭活的注意事项：①水浴箱的水位线超过病毒保存液平面（通常为采集管2/3处）；②灭活过程中水浴箱温度恒定在56℃，以达到有效灭活病毒。
3.咽拭子样本送检。将已灭活样本装入密封箱，由护士送达实验室。运送过程中应保持箱体直立，防止样本倾倒外泄。送检人员与实验室人员核对样本信息，填写交接清单。
（二）SARS-CoV-2核酸RT-PCR检测
RT-PCR是目前SARS-CoV-2核酸检测的常用方法。咽拭子样本灭活病毒后，可在医院PCR实验室完成检测。
1.检测原理。以SARS-CoV-2开放读码框1ab及编码N蛋白基因的特异性保守序列为靶区域，设计荧光检测的特异性引物探针，在RT-PCR仪上，应用RT-PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现样本RNA的检测。检测体系包含有内源性的内标引物和探针，通过检测内标引物是否正常来监测样本采集、提取过程，避免出现假阴性结果。
2.样本要求。咽拭子、鼻咽拭子样本，病毒保存液为灭菌生理盐水或TE缓冲液。痰液样本，往痰液收集管中加入2～3倍无菌生理盐水，充分振荡混匀，静置30分钟，取1mL混合液3000rpm离心30秒后，留取上清液作为待测样本备用。肺泡灌洗液可直接用于核酸提取。样本可在56℃条件下35分钟灭活病毒后进行实验。
3.实验操作。
（1）RNA提取：根据实验室情况进行手工提取或使用核酸提取仪进行RNA提取。
（2）PCR扩增：在RT-PCR仪上设定相应的程序，将RNA模板、阴性对照、阳性对照配以PCR反应液，在RT-PCR仪进行检测，检测过程包括RNA逆转录、DNA扩增与荧光读取。
4.质量控制。
（1）阴性对照：病毒基因检测通道及内标通道均为无Ct值（cycle threshhold，PCR反应的荧光强度超过设定的阈值所需的循环数）或Ct＞40（扩增循环数为45）。(https://www.daowen.com)
（2）阳性对照：病毒基因检测通道及内标通道Ct≤35（扩增循环数为45）。
（3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。
5.结果判定。
（1）分析内标通道是否有扩增曲线，且Ct≤40（扩增循环数为45），若有则表示本次检测有效，可继续进行后续分析。
①若任一病毒基因检测通道检测到典型S型扩增曲线，且Ct≤40（扩增循环数为45），判定该结果为阳性；
②若病毒基因检测通道未检测到典型S型扩增曲线（No Ct），判定该结果为阴性。
（2）若内标通道无Ct值或Ct＞40（扩增循环数为45），表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新进行实验。
（3）对于阳性样本及病毒培养物，内标检测结果不做要求；对于阴性样本，其内标检测应为阳性，若其内标检测为阴性，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对该样本重新采样，进行重复实验。
（4）灰度区结果判定：若某样本在病毒基因检测通道中荧光信号有明显增幅，但Ct＞40（扩增循环数为45），则该样本处于灰度区，需要复检。如复检结果仍处于灰度区，则判断为阳性。
6.注意事项。
（1）下呼吸道样本的阳性检出率高于上呼吸道样本，拭子样本只能使用铝杆或塑料杆的人造合成拭子头，不允许使用木杆的海藻酸钙或棉质拭子头，后者易造成核酸降解。
（2）实验中建议设置3个阴性对照、1个阳性对照，阴性对照应随机分布，若样本数量较少，可根据实际情况将阴性对照减少为2个或1个。
（3）PCR扩增最后3～5个循环为试剂灰度区，灰度区的具体定义参照试剂盒说明书。在试剂灰度区出现典型S型扩增曲线的样本，通常认为处于试剂盒检测限临界值，需要复检。
（4）SARS-CoV-2核酸检测阳性者，需结合流行病学史和临床表现进行分析；SARS-CoV-2核酸检测阴性者，不能排除SARS-CoV-2感染，应进行多次采样或结合其他检测结果进行分析。
（5）SARS-CoV-2是一类线性单股正链RNA病毒，具有高度变异性的特点，在传播过程中其核酸序列可发生大量变异。如果核酸的变异发生在引物结合区域，则导致假阴性结果。