五、砷盐检查法

五、砷盐检查法

砷盐多由药物生产过程所使用的无机试剂引入，属毒性杂质，须严格控制其限量，在多种药物中要求检查砷盐。《中国药典》采用古蔡氏法、二乙基二硫代氨基甲酸银法检查药物中的微量的砷盐。

（一）古蔡氏法

1.仪器装置 如图4-1所示。

测试时，于导气管C中装入醋酸铅棉花60 mg（装管高度为60～80 mm），再于旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸（试纸大小以能覆盖孔径而不露出平面外为宜），盖上旋塞盖E并固定。

2.原理 金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸，产生黄色至棕色的砷斑，与同条件下一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，颜色不得更深。

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3.操作方法

（1）标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液2 mL，置砷化氢发生瓶（A）中，加盐酸5 mL与水21 mL，再加碘化钾试液5 mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10 min后，加锌粒2 g，立即将装妥的导气管（C）密塞于A瓶上，并将A瓶置25～40℃水浴中，反应45 min，取出溴化汞试纸，即得。

若供试品需经有机破坏后再行检砷，则应取标准砷溶液2 mL代替供试品，照该品种项下规定的方法同法处理后，依法制备标准砷斑。

（2）供试品的检查法：另取一检砷装置，取各品种项下规定量的供试品置A瓶中，加盐酸5 mL与水23 mL溶解后，照标准砷斑制备，自“再加碘化钾试液5 mL”起，依法操作。将生成的砷斑与标准砷斑比较。

结果判断：供试液生成的砷斑比标准砷斑色浅，判为符合规定。

4.讨论及注意事项

（1）标准砷溶液：用三氧化二砷配制贮备液，于临用前取贮备液新鲜配制成标准砷溶液，当天使用，贮备液存放时间一般不宜超过1年。标准砷溶液配制方法收载于《中国药典》四部通则0822，浓度为每1 mL相当于1g的As。

标准砷斑过深或偏浅都会影响比色的准确性，《中国药典》规定标准砷斑为2 mL标准砷溶液（相当2g As）制成。药物中含砷限量不同，可按规定限量改变供试品取用量，不可改变标准砷溶液量。

（2）还原剂：在反应中加入还原剂酸性氯化亚锡及碘化钾，其作用是将供试品中可能存在的As5+还原为As3+（因为As5+生成砷化氢的速度慢）。碘化钾被氧化生成的碘又可被氯化亚锡还原为碘离子，与反应中产生的锌离子形成稳定的配离子，使生成砷化氢的反应不断进行。

氯化亚锡及碘化钾还能有效地抑制微量锑的干扰（100g锑的存在也不致干扰测定），防止锑化氢与溴化汞试纸作用生成锑斑；氯化亚锡还可与锌作用，在锌粒表面形成锌锡齐，起去极化作用（形成局部电池），加快锌与盐酸作用，使氢气均匀而连续地发生。

《中国药典》四部通则8002项规定碘化钾试液应新鲜配制，酸性氯化亚锡配成后3个月内使用。

（3）醋酸铅棉花：供试品及锌粒中可能含有少量硫化物，在酸性条件下产生硫化氢气体，与溴化汞试纸作用产生的硫化汞色斑干扰试验结果，因此用醋酸铅棉花吸收硫化氢。醋酸铅棉花用量太少，除不尽硫化氢，太多或塞得太紧会阻碍砷化氢的通过。所以《中国药典》规定取醋酸铅棉花60 mg，装管高度为60～80 mm，（100g S2-存在下也不干扰测定）。整个实验过程应保持导气管中的醋酸棉花处于干燥状态。

（4）影响因素：氢气发生的速度将影响砷化氢的逸出速度，砷斑的色泽和清晰程度与此有关。而氢气的发生速度与溶液的酸度、锌粒的粒度与用量以及反应温度等有关。《中国药典》在操作中已将上述条件明确规定，严格操作规范即可，锌粒应无砷，粒度应通过一号筛，粒度较大时，用量酌情增加，反应时间延长为1 h。

（5）溴化汞试纸：滤纸质量对溴化汞试纸有影响，应采用质地疏松的定量滤纸（勿用定性滤纸），所得砷斑方色调鲜明，梯度规律。溴化汞试纸应置棕色磨口具塞玻璃瓶中保存。

（6）砷斑：实验所呈砷斑不够稳定，遇光、热及湿气则褪色，因此反应中应保持干燥及避光，并立即比较结果。应用镊子取用溴化汞试纸，不可用手接触生成的砷斑部分。如需保存，可将砷斑在石蜡饱和的石油醚溶液中浸过晾干或避光置于干燥器内，也可将砷斑用滤纸包好夹在记录本中保存。

（7）供试品处理：

1）供试品若为硫化物、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等，在酸性溶液中生成硫化氢或二氧化硫气体，与溴化汞作用生成黑色硫化汞或金属汞，干扰砷斑检查。应先加硝酸处理，使其氧化成无干扰的硫酸盐，过量的硝酸及产生的氮的氧化物应蒸干除尽。如硫代硫酸钠中砷盐的检查。

2）供试品若为铁盐，能消耗碘化钾、氯化亚锡等还原剂，影响测定条件，并能氧化砷化氢而干扰测定。解决问题的方法是，先加酸性氯化亚锡试液，将Fe3+还原为Fe2+后再检查。如枸橼酸铁铵中砷盐检查。

3）供试品若为强氧化剂或可在酸性溶液中产生强氧化性物质者，如亚硝酸钠在酸性溶液中能产生亚硝酸和硝酸，不仅消耗锌粒且产生氮的氧化物氧化新生态的氢，影响砷化氢的生成。因此，需加入硫酸进行分解后依法测定。

4）药物为锑盐时，生成的锑化氢与溴化汞试纸作用，产生灰色锑斑[Sb H2（HgBr）]，干扰比色，应改用白田道夫法；能溶解于水，且不干扰检查的药物，直接依法检查。

5）多数环状结构的有机药物，因砷在分子中可能以共价键结合，要先进行有机破坏后进行检查，否则检出结果偏低或难以检出。有机破坏时，所用试剂的含砷量若超过1g，除另有规定外，应取同量的试剂按供试品同样方法处理，最后加入一定量标准砷液，制备标准砷斑，进行比较。常用的有机破坏方法有碱破坏法和酸破坏法。若溶于水的脂肪族有机酸及其盐（枸橼酸、乳酸及其盐，氨基己酸，葡萄糖酸钙等），一般可直接依法检查，不需有机破坏。

（8）对实验用品和试剂的要求：实验所用检砷器和试液等照本法检查，均不应生成砷斑，或经空白试验至多生成仅可辨认的斑痕。制备标准砷斑和供试品砷斑的检砷器瓶内液面到溴化汞试纸之间的距离应相同，导气管的内径应相同，以免生成的色斑大小不一致，影响比色的准确度。新购置的仪器装置，在使用前应检查是否符合要求。可将所使用的仪器装置依法制备标准砷斑，所得砷斑应呈色一致。同一套仪器应能辨别出标准砷溶液1.5 mL与2.0 mL所呈砷斑的深浅。

（9）注意平行原则：本法反应灵敏度约为0.75g（以As计），适用于含锑100g以下的药物中微量砷盐的检查。含锑药物可改用白田道夫法检查砷盐。

（二）二乙基二硫代氨基甲酸银法（Ag-DDC法）

本法不仅可用于砷盐的限量检查，也可用作微量砷盐的含量测定，为《中国药典》和UPS收载的方法。

1.装置 如图4-2所示。

测试时，于导气管C中装入醋酸铅棉花60 mg（装管高度约80 mm），D管精密加入二乙基二硫代氨基甲酸银试液5 mL，其余同古蔡氏法。

2.原理 金属锌与酸作用，产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应，生成具有挥发性的砷化氢，砷化氢遇二乙基二硫代氨基甲酸银，使其还原产生红色的胶态银，用目视比色法或在510 nm波长处测定吸光度，再与一定量标准砷溶液用同法处理后得到的有色溶液进行比较，以判断药物中砷盐是否超限。

其中Ag-DDC的结构为

图4-2 Ag-DDC法检砷装置

1.砷化氢发生瓶 2.中空磨口塞3.导气管 4.平底玻璃管（具5.0 mL刻度）

化学反应为

3.操作方法

（1）标准砷对照液的制备：精密量取标准砷溶液2 mL，置A瓶中，加盐酸5 mL与水21 mL，再加碘化钾试液5 mL与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10 min后，加锌粒2 g，立即将导气管C与A瓶密塞，使生成的砷化氢气体导入D管中，并将A瓶置25～40℃水浴中反应45 min，取出D管，添加三氯甲烷至刻度，混匀，即得。

若供试品需经有机破坏后再行检砷，则应取标准砷溶液代替供试品，照各品种项下规定的方法同法处理后，依法制备标准砷对照液。

（2）供试品检查法：取照各品种项下规定方法制成的供试品溶液，置A瓶中，照标准砷对照液的制备，自“再加碘化钾试液5 mL”起，依法操作。将所得溶液与标准砷对照液同置白色背景上，从D管上方向下观察、比较，所得溶液的颜色不得比标准砷对照液更深。必要时，可将所得溶液转移至1 cm吸收池中，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》四部通则0401）在510 nm波长处以二乙基二硫代氨基甲酸银试液作空白，测定吸光度，与标准砷对照液按同法测得的吸光度比较，即得。

结果判断：供试液所得的颜色比标准砷对照液浅，或供试液在510 nm波长处测得吸光度小于标准砷对照液的吸光度，判为符合规定。

4.讨论及注意事项

（1）适用范围：当As浓度为40 mL含1～10g范围内时，线性关系良好，显色在2 h内稳定，重现性好，可用于砷盐的限量检查和含量测定。

（2）测定条件：本法需用有机碱吸收反应中产生的二乙基二硫代氨基甲酸（HDDC），因该检查反应是可逆反应，加入有机碱使与HDDC结合，有利于反应向右定量进行。《中国药典》采用含三乙胺的二乙基二硫代氨基甲酸银三氯甲烷溶液，显色稳定性及试剂稳定性均好，低毒、无臭，与砷化氢所显颜色在510 nm有最大吸收。因二乙基二硫代氨基甲酸银试液呈浅黄绿色，测吸光度时要用此试液作空白。如遇室温低，按此法操作，标准砷对照液不显色，可将D管置25～40℃水浴加热使显色。

（3）显色剂：二乙基二硫代氨基甲酸银试液在配制后2周内稳定，《中国药典》规定置棕色玻璃瓶中，密塞，置阴凉处保存。本法置25～40℃水浴中反应45 min后，二乙基二硫代氨基甲酸银试液中的三氯甲烷有部分挥发，应添加三氯甲烷至5.00 mL摇匀后比色。

（4）锑的影响：锑化氢与Ag DDC的灵敏度较低，约35g的锑化氢反应后的吸光度仅与1g砷化氢反应所得吸光度相当。反应液中加入40%氯化亚锡溶液3 mL、15%碘化钾溶液5 mL时，500g的锑也不干扰测定。

（5）其他：USP所用的Ag-DDC法检查砷装置、试剂等均与《中国药典》有所不同。对结果的判断采用吸光度法。

5.记录 砷盐检查记录内容有检查方法，供试品及标准砷溶液取用量，操作过程，使用特殊试剂、试液的名称和用量，实验过程中出现的现象及实验结果等。