杂环类药物的分析

四、杂环类药物的分析

（一）结构及性质

1.吡啶类

（1）典型药物结构：

（2）主要性质：

1）吡啶环：

A.具弱碱性。

B.开环反应：吡啶环α、α′位未取代吡啶衍生物反应。

C.可与重金属盐类等沉淀试剂形成沉淀。

2）酰肼基：

A.水解性：易水解为异烟酸和肼。

B.还原性：酰肼基具有较强的还原性，可被不同的氧化剂氧化。

C.缩合反应：可与芳醛化合物发生缩合反应形成腙。

D.可与金属离子络合，形成有色的螯合物，故配置注射剂时应避免与金属器皿接触。

2.苯并二氮杂类

（1）典型药物结构：苯并二氮杂类药物为含氮原子、六元和七元环双并合而成的有机药物，常见的有氯氮、地西泮等。

（2）主要性质：

1）碱性：本类药物结构中，二氮杂七元环上氮原子具有强碱性，苯基取代可使碱性降低。

2）水解性：在强酸性溶液中水解，生成相应的二苯甲酮衍生物，其水解产物的某些基团（如氨基）及性质可供本类药物分析之用。

3）硫酸-荧光反应：可与浓硫酸反应，显不同颜色的荧光。

（二）异烟肼的分析

1.性状 本品为无色结晶，白色或类白色结晶性粉末；无臭；遇光渐变色。本品在水中易溶；在乙醇中微溶；在乙醚中极微溶解。本品的熔点为170～173℃。

2.鉴别

（1）戊烯二醛反应：异烟肼被高锰酸钾或溴水氧化为异烟酸，与溴化氰作用于吡啶环，吡啶环水解形成戊烯二醛，再与芳伯胺（如苯胺、联苯胺等）缩合，形成有色的戊烯二醛衍生物。沉淀颜色随所用芳胺的不同而有所差异，如与苯胺缩合形成黄至黄棕色；与联苯胺则形成粉红至红色。

（2）2，4-二硝基氯苯反应：在无水条件下，吡啶或其衍生物发生反应生成羧基后与2，4-二硝基氯苯共热或共热至熔融；冷却后，加醇制氢氧化钾溶液使溶解，溶液即显紫红色。

（3）沉淀形成反应：与重金属盐类（氯化汞、硫酸铜、碘化铋钾）及苦味酸等沉淀试剂形成沉淀。如异烟肼可与氯化汞形成白色沉淀。

（4）酰肼基团的还原反应：异烟肼的酰肼基具有还原性，可与氧化剂发生反应。

如异烟肼与硝酸银作用，即生成白色异烟酸银盐沉淀（可溶于稀硝酸），加热后生成银镜。

《中国药典》异烟肼的鉴别：取本品约10 mg，置试管中，加水2 mL溶解后，加氨制硝酸银试液1 mL，即发生气泡与黑色混浊，并在试管壁上生成银镜。

（5）缩合反应：异烟肼中未被取代的酰肼基与芳醛缩合形成黄色异烟腙，具有一定的熔点，可用于鉴别。常用的芳醛为香草醛、水杨醛、对二甲氨基苯甲醛等。

《中国药典（2005年版）》异烟肼的鉴别：取异烟肼约0.1 g，加水5 mL溶解后，加10%香草醛的乙醇溶液1 mL，摇匀，微热，放冷，即析出黄色结晶；滤过，用稀乙醇重结晶，在105℃干燥后，依法测定，熔点为228～231℃，熔融时同时分解。

（6）与碱共热分解反应：异烟肼与无水碳酸钠或氢氧化钙共热，可发生脱羧降解，并有吡啶臭味逸出。

（7）紫外吸收光谱法：本类药物的分子结构中均含有芳杂环，在紫外光区有特征吸收，其最大、最小吸收波长及百分吸收系数可供鉴别。在320～355 nm的波长处有较大的宽幅吸收。

（8）红外光谱法：《中国药典》中异烟肼及其片剂、注射剂均采用此法鉴别。

（9）高效液相色谱法：《中国药典》中异烟肼及其片剂、注射剂采用此法鉴别。

3.检查

（1）游离肼：异烟肼在制备时可由原料反应不完全或在贮藏过程中由于降解反应，而引入游离肼。因肼为一诱变剂和致癌物质，因此，国内外药典规定了异烟肼及其制剂中游离肼的限度检查。

1）薄层色谱法：《中国药典》中对异烟肼及其片剂中游离肼的检查，均采用薄层色谱法。

方法：取本品，加丙酮-水（1∶1）溶解并稀释制成每1 mL中含100 mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼对照品，加丙酮-水（1∶1）溶解并稀释制成每1 mL中含0.08 mg（相当于游离肼20g）的溶液，作为对照品溶液。取异烟肼和硫酸肼各适量，加丙酮-水（1∶1）溶解并稀释制成每1 mL中含异烟肼100 mg及硫酸肼0.08 mg的混合溶液，作为系统适用性溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5L，分别点于同一硅胶薄层板上，以异丙醇-丙酮（3∶2）为展开剂，展开，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15 min后检视。系统适用性溶液所显游离肼与异烟肼的斑点应完全分离，游离肼的Rf值约为0.75，异烟肼的Rf值约为0.56。在供试品主斑点前方与对照品溶液主斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。

2）比浊法：JP（15）采用样品中加水杨醛的乙醇溶液观察混浊的方法来控制游离肼的限量。

方法：取异烟肼0.1 g，加水5 mL使溶解，加水杨醛乙醇液（1→20）0.1 mL，迅速振摇混合，放置5 min内溶液不得混浊。

游离肼可与水杨醛反应生成水不溶性的水杨醛腙，呈现混浊。

本法操作简单，但专属性较差。若放置时间过长，异烟肼的反应产物也会产生混浊。

（2）有关物质：《中国药典》中异烟肼及其片剂、注射剂的有关物质检查均采用高效液相色谱的主成分自身对照法。

此外，异烟肼原料药还要进行酸碱度、溶液澄清度与颜色、干燥失重、炽灼残渣、重金属、无菌等一般杂质的检查项目。

4.含量测定

异烟肼的含量测定常用的方法为氧化还原滴定法、非水溶液滴定法、比色法、高效液相色谱法等。

（1）氧化还原滴定法：异烟肼可采用多种氧化剂，在不同的介质中直接滴定或剩余滴定法测定含量。常用的氧化剂有碘、溴、溴酸钾、高锰酸钾、重铬酸钾、亚硝酸钠、硫酸铈等。其中，以碘量法、溴量法、溴酸钾法最为常用。

1）溴酸钾滴定法：异烟肼可在强酸性介质中用溴酸钾滴定液滴定，用甲基橙指示液指示终点，方法简便，结果准确。

《中国药典（2010年版）》注射用异烟肼的含量测定：取装量差异项下的内容物，混合均匀，精密称取约0.2 g，置100 mL容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取25 mL，加水50 mL、盐酸20 mL与甲基橙指示液1滴，用溴酸钾滴定液（0.016 67 mo1/L）缓缓滴定（温度保持在18～25℃）至粉红色消失。每1 mL的溴酸钾滴定液（0.016 67 mo1/L）相当于3.429 mg的C6H7N3O。

2）剩余碘量法：USP（XⅦ）曾采用本法测定异烟肼的含量。

3）剩余溴量法：BP（2009）采用本法测定异烟肼注射液和含量。

（2）非水溶液滴定法：异烟肼的吡啶环具有碱性，可在非水溶剂中与高氯酸定量生成高氯酸盐，大多采用在冰醋酸中用高氯酸的冰醋酸标准液滴定，以结晶紫为指示剂；亦可使用高氯酸的二氧六环溶液为滴定液，甲基红为指示剂。

JP（15）方法如下：取本品（干燥品）约0.3 g，精密称定，加冰醋酸50 mL与醋酐10 mL溶解后，加α-萘酚苯甲醇试液0.5 mL，用高氯酸滴定液（0.1 mo1/L）滴定，至溶液显黄绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL的高氯酸滴定液（0.1 mo1/L）相当于13.714 mg的C6H7N3O。

《中国药典》中异烟腙采用非水溶液滴定法测定含量，以电位法指示终点。

（3）比色法：异烟肼的比色测定方法，主要是利用酰肼基团与试剂缩合或还原呈色。较多地用于含量较低或有共存物干扰的样品（如生物样品）中异烟肼的测定。

1）4-硝基苯甲醛或吡哆醛比色法：异烟肼与4-硝基苯甲醛或吡哆醛可缩合成腙，显黄色，其吸收为一宽峰（409～430 nm）可进行比色测定；与吡哆醛缩合呈黄色，其最大吸收在400 nm附近，可采用适当比色计或分光光度计进行测定。

2）7-氯-4-硝基苯并-2-氧-1，3-二氮唑比色法：本法是一种灵敏的比色方法。系利用异烟肼在四硼酸钠的存在下，于无水甲醇中可与该试剂缩合呈橙色，在467 nm波长处有最大吸收。呈色稳定至少90 min，在0.3～5g/mL浓度范围内呈线性。

（4）高效液相色谱法：《中国药典》中异烟肼及其片剂、注射剂采用此法测定含量。

1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.02 mol/L磷酸氢二钠溶液（用磷酸调pH值至6.0）-甲醇（85∶15）为流动相；检测波长为262 nm。理论板数按异烟肼峰计算不低于4 000。

2）测定法：取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取10L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取异烟肼对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

（三）地西泮的分析

1.性状 本品为白色或类白色的结晶性粉末；无臭。本品在丙酮、三氯甲烷中易溶，在乙醇中溶解，在水中几乎不溶。本品的熔点为130～134℃。

2.鉴别

（1）硫酸-荧光反应：苯并二氮类药物溶于（浓）硫酸后，在紫外光下（365 nm），呈现不同颜色的荧光。如地西泮为黄绿色；氯氮为黄色。

若在稀硫酸中反应，则荧光颜色略有差异：地西泮为黄色；氯氮为紫色。

《中国药典》地西泮的鉴别：取本品约10 mg，加硫酸3 mL，振摇使溶解，在紫外光灯（365 nm）下检测，显黄绿色荧光。

（2）水解后呈芳伯胺反应：氯氮加稀盐酸溶解并缓缓煮沸，溶液显芳伯胺的反应。

《中国药典》氯氮的鉴别：取本品约10 mg，加盐酸溶液（1→2）15 mL，缓缓煮沸15 min，放冷；溶液显芳香第一胺类的鉴别反应。

（3）沉淀反应：苯并二氮杂类药物，在盐酸溶液中可与碘化铋钾、硅钨酸等生物碱沉淀剂反应，生成不同颜色的沉淀。

《中国药典》地西泮注射液的鉴别：取本品2 mL，滴加稀碘化铋钾试液，即生成橙红色沉淀。

（4）氯化物的鉴别反应：本类药物大多为有机氯化合物，用氧瓶燃烧法破坏，处理后显氯化物的反应。

《中国药典》地西泮的鉴别：取本品20 mg，用氧瓶燃烧法进行有机破坏，以5%氢氧化钠溶液5 mL为吸收液，燃烧完成后，用稀硝酸酸化，并缓缓煮沸2 min，溶液显氯化物鉴别（1）的反应。

（5）紫外吸收光谱：《中国药典》地西泮的鉴别：取本品，加0.5%硫酸甲醇溶液制成每1 mL中5g的溶液，照紫外-可见分光光度法测定，在242 nm、284 nm与366 nm波长处有最大吸收；在242 nm波长处的吸光度约为0.51，在284 nm波长处的吸光度约为0.23。

（6）红外分光光度法：《中国药典》中大多数苯并二氮杂类药物如地西泮等用此法进行鉴别。

（7）高效液相色谱法：《中国药典》中地西泮及其片剂、注射剂和氯氮的制剂均用此法进行鉴别。

3.检查 苯并二氮杂类药物由于生产工艺的原因或贮藏期间出现分解，致使药物中存在中间体、副产物、分解产物等杂质（有关物质）。

USP（24）和BP（2003）用薄层色谱法检查氯氮的有关物质。

《中国药典》中氯氮、地西泮及其制剂的有关物质检查用高效液相色谱的主成分自身对照法。

此外，地西泮原料药还要进行乙醇溶液的澄清度与颜色、干燥失重、炽灼残渣、氯化物等一般杂质的检查项目。

4.含量测定

（1）非水溶液滴定法：《中国药典》地西泮的含量测定：取本品约0.2 g，精密称定，加冰醋酸与醋酐各10 mL使溶解，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1 mo1/L）滴定至溶液显绿色。每1 mL的高氯酸滴定液（0.1 mo1/L）相当于28.47 mg的C16H13Cl N2O。

（2）比色法：地西泮及氯氮的比色测定多利用其经酸水解后的产物进行。

1）地西泮酸水解产物二苯甲酮衍生物的比色测定：地西泮原料药及其制剂经6 mo1/L盐酸液水解后，所生成的2-甲氨基-5-氯-二苯甲酮，以三氯甲烷提取可得到黄色溶液，在410 nm波长处测其吸光度。

2）地西泮酸水解产物甘氨酸的茚三酮比色法：地西泮的酸水解产物甘氨酸与茚三酮形成稳定的紫色，在570 nm波长处有最大吸收。

3）氯氮水解后重氮化-偶合比色法：氯氮经酸水解产物2-氨基-5-二苯甲酮具有芳伯氨基，经重氮化后与N-（1-萘基）-乙二胺偶合呈色，在540 nm波长处有最大吸收，可用比色测定。

（3）紫外分光光度法：《中国药典（2005年版）》地西泮片采用此法测定含量。

方法：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于地西泮10 mg），置100 mL容量瓶中，加水5 mL，混匀，放置15 min，加0.5%硫酸的甲醇溶液约60 mL，充分振摇，使地西泮溶解，用0.5%硫酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置100 mL容量瓶中，用0.5%硫酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在284 nm的波长处测定吸光度，按C16H13Cl N2O的吸收系数为454计算，即得。

（4）高效液相色谱法：《中国药典》地西泮片剂、注射剂采用此法测定含量。