氢化可的松的分析
（一）性状
氢化可的松为白色或类白色的结晶性粉末；无臭；遇光渐变质。在乙醇或丙酮中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醚中几乎不溶，在水中不溶。
比旋度：取本品，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含10 mg的溶液，照旋光度测定法测定，比旋度为+162°～+169°。
吸收系数：取本品，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含10
g的溶液，照紫外-可见分光光度法，在242 nm的波长处测定吸光度，吸收系数（
）为422～448。
（二）鉴别
1.与羰基试剂的反应 取本品约0.1 mg，加乙醇1 mL溶解后，加临用新制的硫酸苯肼试液8 mL，在70℃加热15 min，即显黄色。
注释：氢化可的松结构中含有C3-酮基和C20-酮基，可以和羰基试剂硫酸苯肼反应，生成黄色的苯腙，用于鉴别。氢化可的松原料药可直接用此反应进行鉴别，片剂、乳膏和注射液则需用适宜的方法预处理排除附加剂的干扰后再利用此反应进行鉴别。
2.与硫酸的呈色反应 取本品约2 mg，加硫酸2 mL使溶解，放置5 min，显棕黄色至红色，并显绿色荧光；将此溶液倾入10 mL水中，即变成黄色至橙黄色，并微带绿色荧光，同时生成少量絮状沉淀。
注释：许多甾体激素类药物能与硫酸、盐酸、磷酸、高氯酸等强酸反应呈色，其中以与硫酸的呈色反应应用最为广泛。甾体激素类药物与硫酸的反应机制为：酮基先质子化，形成正碳离子，然后与
作用呈色，不同的药物可形成不同的颜色或荧光。加水稀释后，水解的作用使
解离，π键生色团增加，π-π*跃迁增强，吸收峰向短波长方向移动，颜色变浅。氢化可的松原料药可直接用此反应进行鉴别，片剂、乳膏和注射液则需用适宜的方法预处理排除附加剂的干扰后再利用此反应进行鉴别。
3.高效液相色谱法 在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
4.红外光谱法 本品的红外吸收图谱应与对照的图谱一致。红外光谱法具有特征性强、专属性好的特点、绝大多数甾体激素类药物的原料药均采用此法进行鉴别。
（三）检查
1.有关物质 有关物质是氢化可的松中存在的具有甾体结构的其他物质，包括残留的原料、中间体、异构体、降解产物等杂质，在2000年版之前的《中国药典》中又名“其他甾体”。《中国药典》二部采用高效液相色谱法中的外标法检查氢化可的松原料药及注射剂中的泼尼松龙，采用主成分自身对照法检查氢化可的松中的其他有关物质。
氢化可的松原料药中有关物质的检查方法：取本品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.5 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀作为对照溶液；另取泼尼松龙对照品，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含5
g的溶液，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20
L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至供试品溶液主成分峰保留时间的3倍。供试品溶液色谱图中如有与对照品溶液色谱图中泼尼松龙峰保留时间一致的峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.5%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰忽略不计。
《中国药典（2000年版）》曾采用薄层色谱法中的高低浓度对比法，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385∶60∶30∶2）为展开剂，以碱性四氮唑蓝试液为显色剂，检查“其他甾体”。《中国药典（2000年版）》二部中对“其他甾体”的检查方法：取本品，加氯仿-甲醇（9∶1）制成每1 mL中含3.0 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加氯仿-甲醇（9∶1）稀释制成每1 mL中含60
g的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述2种溶液各5
L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385∶60∶30∶2）为展开剂，展开后，晾干，在105℃干燥10 min，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品溶液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照溶液的主斑点比较，不得更深。
2.溶出度 氢化可的松片须检查溶出度。根据氢化可的松结构中含有△4--3酮基，为共轭结构，在240 nm波长附近有最大吸收，溶出液中氢化可的松含量的测定采用百分吸收系法。《中国药典》规定氢化可的松在242 nm波长出的吸收系数
为449.3。
《中国药典》中氢化可的松片溶出度的测定方法：取本品，照溶出度与释放度测定法，以水900 mL为溶出介质，转速为50 r/min，依法操作，经30 min时，取溶液滤过，精密量取续滤液5 mL置10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。照紫外-可见分光光度法，在248 nm的波长处测定吸光度，按C21H30O5的吸收系数
为449.3计算每片的溶出量。限度为标示量的70%，应符合规定。
（四）含量测定
根据氢化可的松的结构特征，可用于含量测定的方法很多。比色法、紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法等均可用于氢化可的松的含量测定。
1.高效液相色谱法
（1）外标法：《中国药典》二部采用外标法测定氢化可的松原料药及其注射液的含量。
1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（28∶72）为流动相；检测波长为245 nm。取氢化可的松与泼尼松龙，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含5
g的溶液，取20
L注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为泼尼松龙与氢化可的松，泼尼松龙峰与氢化可的松峰的分离度应符合要求。
2）测定法：取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20
L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取氢化可的松对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
（2）内标法：《中国药典》也曾采用内标法测定氢化可的松原料药的含量。
1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（70∶30）为流动相；检测波长为240 nm。理论板数按氢化可的松峰计算应不低于2 000，氢化可的松峰和内标物质峰的分离度应符合要求。
2）内标溶液的制备：取炔诺酮，加甲醇制成每1 mL中含0.40 mg的溶液，即得。
3）测定法：取氢化可的松对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.50 mg的溶液；精密量取该溶液与内标溶液各5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；取5～10
L注入液相色谱仪，记录色谱图；按另取本品适量，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。
2.紫外-可见分光光度法
（1）百分吸收系数法：《中国药典》二部采用百分吸收系数法测定氢化可的松片的含量，根据其在242 nm波长处的吸收系数
为435计算其含量。《中国药典》也曾采用此法测量氢化可的松原料药和注射液的含量。
1）供试品溶液的制备：取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于氢化可的松20 mg），置100 mL容量瓶中，加无水乙醇约75 mL，振摇1 h使氢化可的松溶解，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
2）测定法：照紫外-可见分光光度法，在242 nm的波长处测定吸光度，按C21H30O5的吸收系数
为435计算，即得。
（2）四氮唑盐比色法：肾上腺皮质激素C17位上的α-醇酮基具有还原性，在强碱性溶液中能将四氮唑盐定量地还原为有色的甲
，生成的颜色随所用试剂和条件的不同而异，多为红色或蓝色。同时测定一定浓度供试品溶液和对照品溶液在相同条件下与四氮唑盐反应后反应产物的吸光度，即可用对照法计算供试品的含量。《中国药典》氢化可的松乳膏的含量测定就采用此法。
1）四氮唑盐的种类：常用的四氮唑盐有以下两种。
A.氯化三苯四氮唑：即2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC），其还原产物为不溶于水的深红色三苯甲
，λmax为480～490 nm，也称红四氮唑。氢化可的松乳膏的含量测定即采用该显色剂。
B.蓝四氮唑：即3，3′-二甲氧苯基-双-4，4′-（3，5-二苯基）氯化四氮唑，又称蓝四氮唑（BT），其还原产物为暗蓝色的双甲
，λmax在525 nm左右。TTC和BT的结构如下：
2）反应原理：目前多认为是α-醇酮基失去2个电子被氧化为20-酮-21醛基，在碱催化下分子内部进行重排，有部分形成20-羟基-21-羟基衍生物，而四氮唑盐得到2个电子，开环形成甲
而呈色，以TTC为例，反应方程式如下：
3）氢化可的松乳膏的测定方法：
A.供试品溶液的制备：取本品适量（约相当于氢化可的松20 mg），精密称定，置烧杯中，加无水乙醇约30 mL，在水浴上加热使溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100 mL容量瓶中，同法提取3次，滤液并入容量瓶中，放至室温，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
B.对照品溶液的制备：精密称取氢化可的松对照品约20 mg，置100 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
C.测定法：精密量取供试品溶液与对照品溶液各1 mL，分别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙醇9 mL与氯化三苯四氮唑试液1 mL，摇匀，各再精密加氢氧化四甲基铵试液1 mL，摇匀，在25℃的暗处放置40～45 min，照紫外-可见分光光度法，在485 nm的波长处分别测定吸光度，计算，即得。
4）讨论：测定时各种因素如皮质激素的结构、溶剂、反应温度和时间、水分、碱的浓度、空气中的氧等对甲
形成的速度、呈色强度和稳定性都有影响。
A.基团的影响：一般认为，C11-酮基取代的甾体反应速度快于C11-羟基取代的甾体；C21-羟基酯化后其反应速度减慢，当酯化的基团为三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯时，反应速度更慢。
B.溶剂和水分的影响：含水量大时会使呈色速度减慢，但含水量不超过5%时，对结果几乎无影响，故一般选用无水乙醇作溶剂；醛具有一定的还原性，能还原氯化三苯四氮唑，使测得的吸光度偏大，测量结果偏高，故最好应选用无醛乙醇作溶剂。
C.碱的种类及加入顺序的影响：在各种碱性试剂中，采用氢氧化四甲基铵能得到满意结果，因此最为常用。研究发现，当皮质激素和氢氧化四甲基铵长时间（24 h）接触后，皮质激素有部分分解。因此，应先加四氮唑盐溶液再加碱液。
D.空气中氧及光线的影响：反应产物对光敏感，必须用避光容器并置于暗处显色；当达到最大呈色时间后，立即测定吸光度。氯化三苯四氮唑形成的甲
对空气中的氧敏感，氧能够明显影响产物的颜色和稳定性。因此，《英国药典》曾规定在加入试剂后要向容器中冲入氮气。
E.反应温度与时间的影响：呈色反应速度随温度的升高而加快，一般应以室温或30℃恒温条件下显色，结果的重现性较好。《中国药典》规定的反应条件是在25℃的暗处放置40～45 min。