二、光谱分析法
光谱分析法包括紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分析法和火焰光度法等。药物含量测定中，以紫外-可见分光光度法最常用，其具有应用广泛、灵敏度高、准确度高、仪器价格较低廉、操作简单、易于普及等特点，故本章重点介绍此法。
紫外-可见分光光度法适用于具有共轭双键或在一条件下能与某些试剂（显色剂）定量作用而产生颜色的药物。由于仪器或操作原因，对同一供试液测得的吸光度变异性较大，因此，原料药的含量测定，除甾体激素药物和某些抗生素外，尽可能避免使用紫外-可见分光光度法，特别是吸收系数法。
紫外-可见分光光度法对药物进行含量测定及结果处理，基于朗伯-比尔定律：
式中，A为吸收度；
为百分吸收系数；l为液层厚度，cm；c为测定溶液浓度，g/100 mL。
紫外-可见分光光度法用于含量测定，按操作方式及结果处理不同，一般有以下几种：
（一）对照品比较法
按各品种项下的方法，分别配制供试品测定溶液和对照品测定溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的（100±10）%，所用溶剂也应完全一致，在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度后，按下式计算供试品中被测溶液的浓度：
式中，cX为供试品测定溶液的浓度；AX为供试品测定溶液的吸光度；cR为对照品测定溶液的浓度；AR为对照品测定溶液的吸光度。
对照品比较法由于采用对照品与供试品平行操作的方式，具有消除仪器误差、方法误差，以及降低不同实验室间测定结果的变异系数的优点，是法定方法中采用较多的一种方法。
1.原料药百分含量计算 公式如下：
式中，A供为供试品测定液的吸光度；c对为对照品测定溶液的浓度，g/mL；A对为对照品测定液的吸光度；MS为称取的供试品量，g；V为固体药物配制成溶液（供试品溶液）体积，mL；n为供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数。
2.片剂标示量百分含量计算 公式如下：
式中各符号意义同式（5-11），平均片重及标示量单位均为g。
应用示例
格列喹酮片含量测定：取本品10片，精密称定，研细，称取细粉适量，置100 mL容量瓶中，加甲醇约70 mL，置水浴中超声15 min使格列喹酮溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在310 nm的波长处测定吸光度；另取格列喹酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成浓度为0.112 mg/mL的对照品溶液，同法测定，按对照法计算即得。
实验数据：AX=0.560，Ar=0.571，cr=0.112 mg/mL，MS=0.652 0 g，W10=3.861 g，标示量=30 mg/片。
解：供试品为固体，配制的体积作为100 mL，供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数为
3.注射液标示量百分含量计算 公式如下：
式中，V为供试品注射液制成供试品溶液的体积，mL；n为供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数，其他各符号意义同式（5-11）；每支容量单位为mL；标示量单位为g。
（二）吸收系数法
本法是按各品种项下的方法配制供试品测定溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。
1.原料药百分含量计算 公式如下：
式中，A为测定的吸光度；
为供试品的百分吸收系数；V为固体药物配制成溶液（供试品溶液）的体积，mL；n为供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数；MS为供试品的量，g。
应用示例
对乙酰氨基酚的含量测定：精密称定对乙酰氨基酚（C8H9NO2）约40 mg，置250 mL容量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液50 mL溶解后，加水至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加0.4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在257 nm的波长处测定吸光度，C8H9NO2的吸收系数（
）为715。
实验数据：MS=42.0 mg，A=0.598，
=715。
解：供试品为固体，配制的体积作为250 mL，供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数为
代入式（5-14），计算得
2.片剂标示量百分含量的计算 公式如下：
式中有关符号意义同式（5-14），平均片重及标示量单位均为g。
应用示例
氨苯蝶啶片的含量测定：取本品10片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于氨苯蝶啶50 mg），置烧杯中，加冰醋酸与水各25 mL，小心加热，搅拌使氨苯蝶啶溶解，放冷，移至500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置100 mL容量瓶中，加稀醋酸稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在360 nm波长处测定吸光度，按C12H11N7的吸收系数（
）为843计算，即得。
实验数据：M10=1.024 0 g；取样量为0.112 0 g；标示量为50 mg/片；吸光度为0.470。
解：代入式（5-15），计算得
3.注射液标示量百分含量的计算 公式如下：
式中，A为测定的吸光度；
为供试品的百分吸收系数；V为注射液配制成溶液（供试品溶液）体积，mL；n为供试品溶液稀释为供试品测定液的稀释倍数；VS为注射液取样量，mL。
应用示例
精密量取维生素B6注射液2 mL，置500 mL容量瓶中，加盐酸溶液（9→1 000）稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加盐酸溶液（9→1 000）稀释至刻度，摇匀，照紫外-可见分光光度法，在291 nm波长处测得吸光度，按维生素B6的吸收系数
）为427计算维生素B6注射液标示量的百分含量。
实验数据：取样量为2.00 mL，标示量为1 mL∶50 mg，吸光度A=0.467。
解：
（三）比色法
供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂显色后，测定吸光度以计算其含量的方法称为比色法。
用比色法测定时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后，以相应试剂为空白，在各品种规定的波长处测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
也可取对照品溶液和供试品溶液，同法操作，以相应试剂为空白，在各品种规定的波长处测定对照溶液和供试溶液的吸光度，按上述各法计算供试品含量。
由于显色时影响显色深浅的因素很多，应取供试品与对照品或标准品平行操作。
（四）计算分光光度法
本方法有多种，使用时均应按各品种项下规定的方法进行。在此仅介绍等吸收双波长消去法。
原理：在两个不同的波长处测定吸光度，以两波长处吸光度的差值（ΔA）作为定量的依据来测定含量的方法。应用本法可以不经分离直接测定两组分样品的含量。
一般选择被测组分的最大吸收波长作为测定波长（λ2），此处干扰组分有吸收，为消除干扰组分的干扰，需另选择一参比波长（λ1），使干扰组分在此两波长处的吸光度相等。分别测定样品在此两波长处的吸光度，以此两波长处吸光度的差（ΔA）作为定量的依据，可消除干扰组分的干扰。
设样品在λ2和λ1处的吸光度分别为A2和A1，测定组分在λ2和λ1处的吸光度分别为
，干扰组分在λ2和λ1处的吸光度分别为
，即
从以上推导可以看出，由于在一定条件下，ΔE为一常数，所以ΔA和浓度（c）有线性关系，用ΔA作为定量的依据，可以消除干扰组分的干扰，因此可以用对照品比较法测定药物的含量。