二、色谱法

二、色谱法

本法是利用药物与杂质吸附性质或在不同溶剂中分配系数的差异，将药物与杂质分离和检查的一种方法。常有以下三种：

（一）薄层色谱法

薄层色谱法操作简便、快速、灵敏度高，不需特殊设备，在杂质检查中应用广泛，《中国药典》常用的方法有：

1.杂质对照品法 根据杂质限量，取一定浓度的已知杂质的对照品溶液和供试品溶液，分别点样于同一薄层板上，展开，定位，检视。供试品中所含该项杂质的斑点与对照品溶液或系列杂质对照品溶液色谱中的主斑点比较，以判断供试品中的特殊杂质是否超过限量。

例如《中国药典》异烟肼中游离肼的检查：取本品，加丙酮-水（1∶1）溶解并稀释制成每1 mL中约含100 mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加丙酮-水（1∶1）制成每1 mL中约含0.08 mg（相当于游离肼20g）的溶液，作为对照品溶液；取异烟肼和游离肼各适量，加丙酮-水（1∶1）溶解并稀释制成每1 mL中分别含异烟肼100 mg及硫酸肼0.08 mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各5L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-丙酮（3∶2）为展开剂，展开，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15 min后检视。系统适用性试验溶液所显游离肼与异烟肼的斑点应完全分离，游离肼的Rf值约为0.75，异烟肼的Rf值约为0.56，在供试品溶液主斑点前方与对照品溶液主斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。

本试验规定了系统适用性试验的要求，对药检工作的标准化和规范化具有重要意义。

本法准确度高，适用于杂质已知、杂质对照品易得的情况。

2.供试品溶液自身稀释对照法（高低浓度对比法） 将供试品溶液按《中国药典》的限量要求，稀释至一定浓度作为对照溶液，将供试品溶液和对照溶液分别点于同一薄层板上，展开、显色、定位、检视，供试品色谱中除主斑点以外的杂质斑点，与自身稀释对照液所显主斑点比较，数目不得多于规定的数目，颜色不得深于对照溶液所显主斑点颜色。本法要求供试品与所检杂质对显色剂所显的颜色应相同，显色灵敏度也应相同或相近。当供试品中有多个杂质存在时，可以配制几种限量的对照品溶液，加以比较。

例如《中国药典》盐酸去氧肾上腺素中有关物质的检查：避光操作。取本品，加甲醇溶解并定量稀释制成每1 mL中含20 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇稀释成每1 mL中含0.10 mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述2种溶液各10L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异丙醇-三氯甲烷-浓氨溶液（80∶5∶15）为展开剂，展开，晾干，喷以重氮苯磺酸试液使显色。供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液的主斑点比较，不得更深（0.5%）。

此法准确度差，但简便易行，不需制备对照品，还可配成几种限量的对照溶液，适用于杂质的结构不能确定，或无杂质对照品的情况。

3.对照药物法 用与供试品相同的药物作对照品，与供试品溶液同时分别点于同一薄板上，展开、显色、定位、检视，供试品及对照药物色谱中所显主斑点、其他杂质斑点对应比较，以判断供试品中的特殊杂质是否超过限量。对照药物所含待检杂质必须符合限量要求，且本身稳定。

《中国药典》氢溴酸山莨菪碱中其他生物碱的检查方法：取本品与氢溴酸山莨菪碱对照品，分别加甲醇制成每1 mL中含10 mg的溶液，照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10L，分别点于同一氧化铝（中性，活度Ⅱ～Ⅲ级）薄层板上，以三氯甲烷-无水乙醇（95∶5）为展开剂，展开，晾干，喷以稀碘化铋钾试液-碘化钾碘试液（1∶1），供试品溶液除显一个与对照品溶液主斑点位置相同的灰黑色斑点外，不得显其他斑点。

此法适用于无适合的杂质对照品，或供试品所显杂质斑点与主成分斑点的颜色有差异，难以判断结果的情况。

4.其他方法

（1）在规定条件下不允许有杂质斑点存在（灵敏度法）：根据杂质限量，取供试品项下规定量的供试品溶液点于薄层板上，展开、显色、定位、检视，供试品色谱中除主斑点外，不得有其他斑点。《中国药典》阿昔洛韦项下有关物质的检查：取本品加二甲亚砜溶解并稀释制成每1 mL中含10 mg的溶液，照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述溶液5L，点于硅胶F254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨溶液（80∶20∶2）为展开剂，展开，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视，除主斑点外，不得显其他斑点。

（2）杂质对照品法和供试品溶液自身稀释对照法并用：供试品溶液除主斑点外的其他斑点，与相应对照品溶液或系列对照品溶液的主斑点比较，或与供试品溶液自身稀释对照溶液或系列供试品溶液自身稀释对照液的主斑点比较不得更深。

（二）高效液相色谱法

高效液相色谱（HPLC）法具有分离效能高，试样用量少，易于自动化等特点，应用广泛，在杂质检查中应用日趋增多。特别是使用本法既能测定药物的含量，又可同时进行杂质检查。《中国药典》规定应按各品种项下要求，对仪器进行系统适用性试验，以保证仪器达到要求。色谱图的记录时间，除考虑各杂质的保留时间外，一般为主峰保留时间的倍数。采用HPLC法进行杂质检查的方法有：

1.加校正因子的主成分自身对照法

应用示例

盐酸吗啡项下有关物质的检查：

（1）供试品溶液的配制：取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含盐酸吗啡5 mg的溶液，作为供试品溶液。

（2）对照品溶液的配制：精密量取上述供试品溶液适量，用流动相定量稀释制成每1 mL中含5g的溶液作为对照溶液。

（3）系统适用性试验溶液的配制：另取盐酸吗啡对照品适量，加水溶解，制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，量取5 mL，加0.4%的三氯化铁溶液1 mL，置沸水浴中加热10 min，放冷；量取该溶液1 mL，加入磷酸可待因对照品溶液（取磷酸可待因对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含磷酸可待因25g的溶液）1 mL，摇匀，作为系统适用性溶液。

（4）色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.002 5 mol/L庚烷磺酸钠的0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液（含0.1%三乙胺，用磷酸调pH=2.5±0.1）-乙腈（85∶15）为流动相；检测波长为210 nm；柱温为30℃。

（5）照高效液相色谱法（通则0512）试验：

1）取系统适用性溶液20L注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依次为吗啡、伪吗啡与可待因。吗啡的保留时间为7～8 min，伪吗啡的相对保留时间为1.2～1.5 min，可待因的相对保留时间为2.0～2.3 min，各色谱峰之间的分离度均应符合要求。

2）精密量取对照溶液与供试品溶液各20L分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间的4倍。供试品溶液色谱图中如有与伪吗啡保留时间一致的色谱峰，其峰面积乘以校正因子2后，不得大于对照溶液主峰面积的0.4倍（0.4%），可待因与其他单个杂质峰面积均不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍（0.25%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）。供试品溶液色谱图中小于对照溶液主峰面积0.05倍的色谱峰忽略不计。

（6）讨论：

1）校正因子的确定：本法由于没有杂质对照品，这些需做校正计算的杂质，通常以主成分为参照（内标物），并规定这类杂质峰的位置，如用相对于主成分的相对保留时间表示，并载入各品种项下。如上例伪吗啡峰面积乘以校正因子2后与对照溶液主峰面积比较。校正因子也可按下式计算：

式中，AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；cS为内标物质的浓度；cR为对照品的浓度。

2）测定前要按《中国药典》规定调节检测灵敏度（以噪声水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高达满量程的10%～25%，或其峰面积能准确积分（通常含量低于0.5%的杂质，峰面积RSD应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积RSD应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积RSD应小于2%）。

本法特点：不需杂质对照品，准确度好，杂质在规定检测波长下的响应因子与主成分不一致时也可以应用。

2.不加校正因子的主成分自身对照法

检查时，将供试品溶液稀释成一定浓度的溶液，作为对照溶液。调节检测灵敏度后，分别取供试品溶液和对照溶液进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间应为主成分保留时间的2倍，根据所得的供试品溶液中各杂质峰面积（及其总和），与对照液主成分的峰面积比较，以控制供试品中杂质的量。

应用示例

《中国药典》醋酸可的松中“有关物质”的检查：取本品，加乙腈溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，加无水乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件进行试验，取对照溶液20L注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的50%。再精密量取供试品溶液与对照溶液各20L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%），各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍（1.5%）。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.01倍的峰可忽略不计。

醋酸可的松中有关物质可能是合成原料、中间体、副产物等，其结构一般未知，《中国药典》采用供试品的稀释液为对照，以对照溶液主峰面积为参比，控制药物中杂质的量。

运用本法检查杂质时，若供试品中的部分杂质未能与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ，色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积，然后依法计算。

本法特点为不需杂质对照品，能同时控制各个杂质和其杂质总量的限度。适用于杂质未知或未建立杂质对照品（但单一杂质含量应较少），或杂质峰面积和主成分峰面积相差较大的情况。该法的前提是杂质与主成分的响应因子基本相同，否则杂质定量的误差可能较大。

3.内标法

（1）测定方法：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算校正因子。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

式中，AX为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；C x为供试品（或其杂质）的浓度；A′S为内标物质的峰面积或峰高；c′S为内标物质的浓度；f为校正因子。

此法中的校正因子是通过选取药物和杂质以外的化合物作为内标物测得的。测定时需要有杂质对照品。若测定校正因子和测定供试品溶液采用同一份内标溶液，则内标溶液不必准确配制。

（2）本法特点：适用于有杂质对照品能够测定杂质校正因子的情况。本法可测定供试品中某个杂质或主成分含量，可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

4.外标法 本法用于测定供试品中某个杂质或主成分含量。

（1）测定方法：按各品种下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：

式中各符号意义同内标法。

（2）本法特点：需杂质对照品，准确度好，但进样量必须准确，以定量环或自动进样器进样为好。

应用示例

《中国药典》头孢拉定中“头孢氨苄”的检查：照本品含量测定项下的方法制备供试品溶液，另取头孢氨苄对照品20 mg，用流动相溶解并稀释成每1 mL含0.04 mg的溶液为对照品溶液，照含量测定项下的色谱条件，取对照品溶液10L注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使对照液主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，精密量取供试品溶液与对照溶液各10L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，含头孢氨苄以无水物计，不得过5.0%。

5.面积归一化法

（1）测定方法：按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入液相色谱仪，记录色谱图，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，要求不得超过限量。

（2）本法特点：不需要杂质的对照品，简便易行，但测定误差较大，且测定时，溶剂峰面积不得计入总面积内。通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。另外，色谱图的记录时间对能否获悉共存杂质的信息十分重要，除特殊情况，质量标准中一般采用记录至主成分峰保留时间的2～3倍。

（三）气相色谱法

气相色谱法主要用于药物中挥发性杂质及残留有机溶剂的检查。常用的方法有内标法、外标法、面积归一化法，这三种方法与高效液相色谱法相同。除此尚有标准溶液加入法，将某个杂质或待测组分对照品配制成适当浓度的对照溶液，取一定量精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或待测组分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得供试品溶液中某个杂质或待测组分的含量。

也可按下述公式计算，加入对照品溶液前后校正因子应相同，即

式中，cX为供试品中组分X的浓度；AX为供试品中组分X的色谱峰面积；ΔcX为所加入的已知浓度的待测组分对照品的浓度；Ais为加入对照品后组分X的色谱峰面积。

为减少进样误差以内标法定量为好；采用自动进样器进样，可用外标法定量；顶空进样时，由于供试品和对照品处于不完全相同的基质中，采用标准溶液加入法可消除基质效应的影响。当标准溶液加入法与其他定量方法结果不一致时，应以标准溶液加入法结果为准。

应用示例

《中国药典》氯贝丁酯中“对氯酚”的检查：取本品10 g，加氢氧化钠试液20 mL，振摇提取，分取下层液，加水5 mL振摇洗涤后，留作挥发性物质检查用。上述水洗液并入碱性提取液中，用三氯甲烷振摇洗涤2次，每次5 mL，弃去三氯甲烷液，加稀盐酸使成酸性后，再用三氯甲烷提取2次，每次5 mL，合并三氯甲烷提取液，并加三氯甲烷稀释成10 mL，作为供试品溶液；0.002 5%对氯酚的三氯甲烷溶液作为对照品溶液。照气相色谱法（通则0521）在2 m玻璃色谱柱、以甲基硅橡胶（SE-30）为固定液，涂布浓度为5%、柱温为160℃、氮气为载气、检测器为氢火焰离子化检测器的条件下测定，对氯酚不得过0.002 5%。

利用对氯酚易挥发且对热稳定的特点，采用气相色谱法检查其是否超过限度。由于对氯酚为极性化合物，氯贝丁酯的极性较对氯酚小，而采用非极性固定液SE-30，能使药物在色谱柱内滞留时间长，致使极性较大的对氯酚先出峰，能满足分离和检测的要求。