氨基糖苷类抗生素的分析

三、氨基糖苷类抗生素的分析

氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇和氨基糖缩合而成的苷，故称为氨基糖苷类抗生素。主要有硫酸链霉素、硫酸庆大霉素、妥布霉素、硫酸阿米卡星、硫酸卡那霉素、硫酸依替米星、硫酸新霉素等。它们的抗菌谱和化学性质都有共同之处。

（一）化学结构与性质

1.典型药物

硫酸链霉素

硫酸巴龙霉素

硫酸庆大霉素

硫酸奈替米星

链霉素（Streptomycin，即链霉素A）的结构为一分子链霉胍和一分子链霉双糖胺结合而成的碱性苷，其中链霉双糖胺是由链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺两部分通过苷键结合而成的。链霉胍与链霉双糖胺间的苷键结合较弱，而链霉糖与N-甲基-L-葡萄糖胺间的苷键结合较牢固。

2.性质

（1）溶解度与碱性：该类抗生素的分子中含有多个羟基（故也称多羟基抗生素）和碱性基团，同属碱性、水溶性抗生素，能与矿酸或有机酸成盐，临床上应用的主要为硫酸盐。其硫酸盐易溶于水，多不溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚等有机溶剂。

（2）旋光性：本类抗生素分子结构中含有多个氨基糖，具有旋光性。如硫酸庆大霉素的比旋度为+107°～+121°（水溶液）；硫酸巴龙霉素的比旋度为+50°～+55°（水溶液）。

（3）苷的水解与稳定性：含有二糖胺结构的抗生素（如链霉素、巴龙霉素、新霉素），分子中氨基葡萄糖与链霉糖或D-核糖之间的苷键较强，而链霉胍与链霉双糖胺（苷元与二糖胺）间的苷键结合较弱。一般的化学反应只能将它们分解为一分子苷元和一分子双糖。链霉素的硫酸盐水溶液，一般以pH=5.0～7.5最为稳定，过酸或过碱条件下易水解失效。在酸性条件下，链霉素水解为链霉胍和链霉双糖胺，进一步水解则得链霉糖和甲基葡萄糖胺；碱性也能使链霉素水解为链霉胍及链霉双糖胺，并使链霉糖部分发生分子重排，生成麦芽酚，这一性质为链霉素所特有，可用于鉴别和定量分析。

硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星等对光、热、空气均较稳定，水溶液亦稳定，pH=2.0～12.0时，100℃加热30 min活性无明显变化。

（4）紫外吸收光谱：链霉素在230 nm处有紫外吸收。

（二）硫酸链霉素的质量分析

1.性状 本品为白色或类白色的粉末；无臭或几乎无臭；有引湿性。本品在水中易溶，在乙醇中不溶。

2.鉴别

（1）坂口反应：取本品约0.5 mg，加水4 mL溶解后，加氢氧化钠试液2.5 mL与0.1%8-羟基喹啉的乙醇溶液1 mL，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。

注释：此反应为链霉素水解产物链霉胍的特有反应，在碱性溶液中，链霉胍与8-羟基喹啉乙醇溶液作用，再加次溴酸钠试液，溶液显橙红色。

（2）麦芽酚反应：取本品约20 mg，加水5 mL溶解后，加氢氧化钠试液0.3 mL，置水浴上加热5 min，加硫酸铁铵溶液（取硫酸铁铵0.1 g，加0.5 mol/L硫酸溶液5 mL使溶解）0.5 mL，即显紫红色。

注释：麦芽酚反应为链霉素的特征反应。链二霉素在碱性溶液中，链霉糖经分子重排使环扩大形成六元环，然后消除N-甲基葡萄糖胺和链霉胍生成麦芽酚（α-甲基-β羟基-γ-吡喃酮），后者在弱酸性溶液中与Fe3+形成紫红色配位化合物，反应式如下：

（3）红外光谱法：本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。

（4）硫酸盐鉴别反应：本品的水溶液显硫酸盐的鉴别反应。

3.检查

（1）有关物质：取本品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中约含链霉素3.5 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用水定量稀释制成每1 mL中约含链霉素35g、70g和140g的溶液，作为对照溶液（1）、（2）和（3）。照高效液相色谱法测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.15 mol/L的三氟醋酸溶液为流动相，流速为0.5 mL/min，用蒸发光散射检测器检测（参考条件：漂移管温度为110℃，载气流速为2.8 L/min）。取链霉素标准品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中约含链霉素3.5 mg的溶液，置日光灯（3 000 lx）下照射24 h，作为分离度溶液，取妥布霉素标准品适量，用分离度溶液溶解并稀释制成每1 mL中约含妥布霉素0.06 mg的混合溶液，量取10L注入液相色谱仪，记录色谱图。链霉素峰保留时间为10～12 min，链霉素峰与相对保留时间约为0.9处的杂质峰的分离度和链霉素峰与妥布霉素峰的分离度应分别大于1.2和1.5。精密量取对照溶液（1）、（2）和（3）各10L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以对照溶液浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，相关系数（r）应不小于0.99。另取供试品溶液，同法测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰（硫酸根峰除外），用线性回归方程计算，单个杂质不得过2.0%，杂质总量不得过5.0%。

注释：有关杂质检查的对象为链霉素B，链霉素B是由链霉素分子中N-甲基葡萄糖胺的C4位上酚羟基连接一个D-甘露糖组成的。链霉素B是在发酵中由菌种（环形孢子放线菌）产生的，其生物活性仅为链霉素的20%～25%，能被甘露糖链霉素B苷酶水解成甘露糖和链霉素。因此，如果在生产过程中，提取、精制不完全，链霉素中就很可能残存活性较低的链霉素B。

（2）可见异物：取本品5份，每份为制剂最大规格量，加微粒检查用水溶解，依法检查，应符合规定（供无菌分装用）。

（3）不溶性微粒：取本品3份，加微粒检查用水溶解，依法检查，每1 g样品中，含10m及10m以上的微粒不得过6 000粒，含2m及2m以下的微粒不得过600粒。供无菌分装用。

（4）异常毒性：取本品，加氯化钠注射液制成每1 mL中约含2 600单位的溶液，依法检查，按静脉注射法给药，观察24 h，应符合规定（供注射用）。

4.含量测定

精密称取本品适量，加灭菌水定量制成每1 mL中约含1 000单位的溶液，照抗生素微生物检定法测定。1 000链霉素单位相当于1 mg的C21H39N7012。

注释：氨基糖苷类抗生素的效价测定主要有微生物检定法和HPLC法。微生物检定法的测定结果与临床疗效更加一致，但操作过程烦琐，时间长。采用HPLC法时，由于本类药物多数无紫外吸收，不能直接用紫外或荧光检测器，需要进行柱前或柱后衍生化，或采用电化学检测器、蒸发光散射检测器检测，《中国药典》采用HPLC-蒸发光散射法测定硫酸卡那霉素、硫酸依替米星等药物的含量。

（三）链霉素的其他分析方法

1.N-甲基葡萄糖胺反应 链霉素的水解产物N-甲基葡萄糖胺，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合，形成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性乙醇溶液反应，生成樱桃红色缩合物。

2.硫酸盐反应 链霉素常以硫酸盐形式供药用，可利用硫酸盐能与氯化钡试液生成白色硫酸钡沉淀进行鉴别。

3.BP（2009版）采用薄层色谱法鉴别硫酸链霉素

鉴别方法：以7%（w/v）磷酸二氢钾溶液为展开剂，分别配制1 mg/mL的硫酸链霉素供试品溶液和对照品溶液，将上述2种溶液在硅胶薄层板上分别点样10L，用流动相展开12 cm，室温下挥干溶剂，喷以0.2%（w/v）的1，3-萘二酚的乙醇（95%）溶液与硫酸溶液（1→5）的混合液（1∶1）显色，150℃加热5 min，供试品溶液所显主斑点的颜色与Rf值应与对照品溶液一致。