β-内酰胺类抗生素的分析
β-内酰胺类抗生素包括青霉素类和头孢菌素类，它们的分子结构中都含有β-内酰胺环，故称为β-内酰胺类抗生素。临床常用的青霉素类药物有青霉素钾、青霉素钠、阿莫西林、帕拉西林、美罗培南、氨苄西林等，临床常用的头孢类药物有头孢他啶、头孢克洛、头孢呋辛酯等。
（一）药物的结构与性质
1.典型药物 青霉素和头孢菌素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链。氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母核。青霉素类分子中的母核称为6-氨基青霉烷酸（6-Aminopenicillanic Acid，6-APA）；头孢菌素类分子中的母核称为7-氨基头孢菌烷酸（7-Aminocephalosporanic Acid，7-ACA）。由此也可以说，青霉素类的分子结构由侧链RCO—与母核6-APA两部分结合而成；头孢菌素类是由侧链RCO—与母核7-ACA组成。
A：β-内酰胺环；B：氢化噻唑环
青霉素类（Penicillins）
A：β-内酰胺环；B：氢化噻嗪环
头孢菌素类（Cephalosporins）
通常青霉素类分子中含有3个手性碳原子（C2、C5、C6），头孢菌素类分子中含有2个手性碳原子（C6、C7）。由于酰胺基上R及R1的不同，构成各种不同的青霉素和头孢菌素。典型药物结构如下：
青霉素钠
C16H17N2NaO4S 356.38
青霉素V钾
C16H17KN2O5S 388.49
阿莫西林（Amoxicillin）
C16H19N3O5S·3H2O 419.46
头孢克洛
C15H14Cl N3O4S·H2O 385.82
头孢呋辛酯
C20H22N4O10S 510.48
头孢拉啶
C16H19N3O4S 349.40
2.性质
（1）β-内酰胺环的不稳定性：β-内酰胺环是该类抗生素的结构活性中心，其性质活泼，是分子结构中最不稳定部分，其稳定性与含水量和纯度有很大关系。干燥条件下青霉素和头孢菌素类药物均较稳定，室温条件下密封保存可储存3年以上，但它们的水溶液很不稳定，随pH值和温度而有很大变化。青霉素水溶液在pH值为6～6.8时较稳定。本类药物在酸、碱、青霉素酶、羟胺及某些金属离子（铜、铅、汞和银）或氧化剂等作用下，易发生水解和分子重排，导致β-内酰胺环的破坏而失去抗菌活性。
（2）旋光性：青霉素类分子中含有3个手性碳原子，头孢菌素类含有2个手性碳原子，故都具有旋光性。根据此性质，可用于定性和定量分析。
（3）酸性与溶解度：青霉素类和头孢菌素类分子中的游离羧基具有相当强的酸性，大多数青霉素类化合物的pKa在2.5～2.8之间，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。青霉素的碱金属盐水溶液遇酸则析出游离基的白色沉淀。
（4）紫外吸收特性：青霉素类分子中的母核部分无共轭系统，但其侧链酰胺基上R取代基若有苯环等共轭系统，则有紫外吸收特征。如青霉素钾（钠）的R为苄基，因而其水溶液在264 nm波长处具有较强的紫外吸收。而头孢菌素类母核部分具有O-C-N-C-C结构，R取代基具有苯环等共轭系统，有紫外吸收。
（二）青霉素钠的分析
1.性状 本品为白色结晶性粉末；无臭或微有特异性臭；有引湿性；遇酸、碱或氧化剂等迅速失效，水溶液在室温放置易失效。本品在水中极易溶解，在乙醇中溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。
2.鉴别
（1）高效液相色谱法：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
（2）红外光谱法：本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
（3）本品显钠盐鉴别（1）的反应。
3.检查
（1）结晶性：取少许本品，依法检查，应符合规定。
注释：可采用以下方法检查物质的结晶性。①偏光显微镜法，许多晶体具有光学各向异性，当光线通过这些透明晶体时会发生双折射现象。②X线粉末衍射法，结晶质呈现特征的衍射图（尖锐的衍射峰），而非品质的衍射图则呈弥散状。此外，《中国药典》还对头孢地尼、头孢硫脒和青霉素V钾等规定了结晶性检查。
（2）吸光度：取本品，加水制成每1 mL中约含1.80 mg的溶液；照紫外-可见分光光度法《中国药典》测定，在280 nm与325 nm的波长处，其吸光值均不得大于0.10；在264 nm波长处有最大吸收，吸光度应为0.80～0.88。
注释：采用测定杂质吸光度的方法来控制本类抗生素的杂质含量。
（3）青霉素聚合物：采用分子排阻色谱法测定。
1）色谱条件与系统适用性试验：用葡聚糖凝胶G—10（40～120
m）为填充剂，玻璃柱内径为1.0～1.4 cm，柱长为30～40 cm，流动相A为pH=7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液[0.1 mol/L磷酸氢二钠溶液-0.1 mol/L磷酸二氢钠溶液（61∶39）]，流动相B为水，流速每分钟1.5 mL，检测波长为254 nm，量取0.1 mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液100～200
L，注入液相色谱仪，分别以流动相A、B进行测定，记录色谱图。理论板数按蓝色葡聚糖2 000峰计算均不低于400，拖尾因子均应小于2.0。在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2 000峰的保留时间的比值应在0.93～1.07之间，对照溶液主峰与供试品溶液中聚合物峰与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值均应在0.93～1.07之间。取本品约0.4g，置10 mL容量瓶中，加0.05 mg/mL的蓝色葡聚糖2 000溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。量取100～200
L注入液相色谱仪，用流动相A进行测定，记录色谱图。高聚体的峰高与单体和高聚体之间的谷高比应大于2.0。另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液100～200
L，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差应不大于5.0%。
2）对照溶液的制备：取青霉素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.1 mg的溶液。
3）测定法：取本品约0.4 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水适量使溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，立即精密量取100～200
L注入液相色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图。另精密量取对照溶液100～200
L注入液相色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。按外标法以青霉素峰面积计算，青霉素聚合物的量不得过0.08%。
4）原理：《中国药典》规定β-内酰胺类抗生素需检查高分子聚合物。聚合物的检查采用分子排阻色谱法，其分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰后凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等）为填充剂，流动相通常为水溶液或缓冲溶液，可加入一定量的有机溶剂，但一般不超过30%，流速一般为0.5～1.0 mL/min，不宜过快。色谱系统适用性试验一般同HPLC法，但在高分子杂质检查时，某些药物的单体与其二聚体不能达到基线分离时，计算分离度，除另有规定外，R应＞2.0。
高分子杂质定量测定可采用：①主成分自身对照法，一般用于杂质含量较低的药物。②面积归一化法。③限量法，一般用于混合物中高分子物质的控制，通常规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组分。④自身对照外标法。
4.含量测定 采用高效液相色谱法测定。
（1）色谱条件与系统性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾10.6 g，加水至1 000 mL，用磷酸调节pH值至3.4）-甲醇（72∶14）为流动相A，乙腈为流动相B；检测波长为225 nm；流速为每分钟1 mL，以流动相A-流动相B′（70∶30）洗脱；取青霉素系统适用性对照品适量，加水溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，取20
L注入液相色谱仪，记录色谱图、色谱峰，记录的色谱图应与标准图谱一致。
（2）测定法：取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20
L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取青霉素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，其结果乘以1.065 8，即为供试品中C16H17N2NaO4S的含量。
原理：高效液相色谱法能有效地分离供试品中有可能存在的降解产物、原料药及中间体等杂质，适用于本类药物的原料药和各种制剂的分析测定。《中国药典》收载的本类药物除磺苄西林钠采用微生物检定法外，其余均采用高效液相色谱法测定含量。
（三）青霉素类药物的其他分析方法
1.鉴别
（1）羟肟酸铁反应：在碱性溶液中，青霉素族及头孢菌素族药物分子结构中的β-内酰胺环与羟胺作用生成羟肟酸衍生物，然后羟肟酸衍生物在稀酸中与高铁离子（Fe3+）反应生成红色配合物。反应式如下：
《中国药典》中利用此反应鉴别哌拉西林、磺苄西林钠和头孢哌酮等β-内酰胺类抗生素。
头孢哌酮的鉴别：取本品约10 mg，加水2 mL与盐酸羟胺溶液[取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液（取醋酸钠10.3 g与氢氧化钠86.5 g，加水溶解使成1 000 mL）1份，乙醇4份，混匀]3 mL，振摇溶解后，放置5 min，加酸性硫酸铁铵试液1 mL，摇匀，显红棕色。
（2）硫酸-甲醛反应：大多数青霉素族和头孢菌素族药物与硫酸在室温和高温时均无反应发生，而遇硫酸-甲醛溶液则发生较明显的颜色变化，可供鉴别。
鉴别方法：取β-内酰胺类药物2 mg，置试管中，用水0.05 mL润湿，加硫酸2 mL，观察溶液颜色的变化。将试管浸入沸水浴中加热1 min，再观察溶液颜色的变化。另取β-内酰胺类药物2 mg，置另一支试管中，用硫酸-甲醛（50∶1）溶液代替硫酸，重复上述试验，观察溶液颜色的变化。结果见表6-15。
表6-15 β-内酰胺类药物与硫酸及硫酸-甲醛溶液反应现象
注：①几分钟后出现棕黄色。
②颜色变化很快。
（3）茚三酮反应：本类药物具有酰胺结构，少数具有α-氨基酸结构，可发生双缩脲反应和茚三酮反应。如采用薄层色谱法鉴别头孢拉定、氨苄西林时，通常以茚三酮为显色剂。
（4）氧化还原反应：青霉素族抗生素遇氧化剂，如斐林试液或氨制硝酸银试液，可被氧化剂氧化，它可将氧化剂还原，产生红色氧化亚铜或黑色金属银沉淀。
（5）紫外-可见分光光度法：青霉素族药物的6-APA母核中无共轭体系，当侧链部分有苯环或其他不饱和共轭体系时，在紫外光区有吸收；它在弱酸性条件下的水解产物，在紫外光区也有吸收。《中国药典》中头孢唑林钠即采用本法进行鉴别。某些青霉素族药物在性状项下还需进行吸光度检查。鉴别方法主要有以下两种：
1）利用最大或最小吸收波长鉴别：将待测样品配成适当浓度的溶液，直接测定紫外吸收光谱，根据其最大或最小吸收波长进行鉴别。如头孢唑啉钠溶液在272 nm的波长处有最大吸收，可据此进行鉴别。
2）利用水解产物的最大吸收波长与吸光度鉴别：在一定条件下，将待测样品进行水解，测定水解产物的最大吸收波长与吸光度。
《中国药典（2000年版）》中苯唑西林钠的鉴别：取本品，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=3.8）制成每1 mL中含50
g的溶液，量取10 mL，在水浴中加热30 min，立即冷却，以未加热的样品缓冲液作空白，照分光光度法测定，在339 nm的波长处有最大吸收，吸光度约为0.6。
测定原理：苯唑西林钠在弱酸性条件下，加热水解产生的苯唑青霉烯酸在339 nm的波长处有最大吸收。其反应式如下：
（6）核磁共振波谱法：此类药物在重水（D2O）中的核磁共振波谱具有显著特征，利用这一特性，JP（15版）对所收载的头孢氨苄、头孢拉定等药物采用核磁共振波谱法进行鉴别。
（7）薄层色谱法：《中国药典》中收载的头孢拉定及其制剂均采用该法进行鉴别。样品展开后，挥干溶剂，由于头孢拉定的侧链中含有氨基，可与茚三酮缩合呈色，因此可以用0.1%茚三酮溶液为显色剂进行显色。《中国药典》规定，样品溶液与对照品溶液所显主斑点的位置和颜色应相同。
此外，可利用酶对抗生素的专属作用进行鉴别。《中国药典（2000年版）》中青霉素钠的鉴别：取本品与已知含量的青霉素适量，分别加水制成每1 mL中约含50
g的溶液，各取1 mL，加入不少于200单位的青霉素酶溶液1 mL，在37℃灭活1 h后，取灭菌滤纸片，分别用上述溶液浸湿后，用滤纸吸去多余的液体，置于摊布金黄色葡萄球菌的培养基上，在37℃培养约16 h后均无抑菌作用，用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。
2.含量测定
（1）酸碱滴定法：β-内酰胺类抗生素分子结构中的β-内酰胺环可被碱定量水解，利用此性质可测定其含量。
《中国药典（1995年版）》中苯唑西林钠的含量测定方法：取本品约0.5 g，精密称定，加新沸过并用0.01 mol/L氢氧化钠溶液中和至对酚酞指示液恰显红色的水20 mL使溶解，再用0.01 mol/L氢氧化钠溶液中和后，精密加氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）25 mL，摇匀，置水浴中加热20 min，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，加酚酞指示液1～2滴，用盐酸滴定液（0.1 mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL的氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于40.14 mg的苯唑西林钠。反应式如下：
本法操作简便、快速，不需缓冲液和标准品，由于供试品中残留的有机溶剂也会消耗碱液，产生较大的系统误差，而且在测定过程中，特别是在加热水解之后容易吸收二氧化碳，因此也会影响测定结果。为避免空气中二氧化碳的影响，可在瓶口盖一小漏斗或在瓶口装碱石灰吸收管，然后再加热水解，加热完毕后应迅速密塞和冷却，试验用水应使用新煮沸并放冷的蒸馏水。由于供试品的取用量较大，因此多用于测定效价较高的供试品。
（2）碘量法：β-内酰胺类抗生素分子与碘不发生反应，但其在碱性条件下的水解产物与碘能发生化学反应，利用消耗的碘量可计算药物含量。采用碘量法测定时可分两步进行。以青霉素为例，首先β-内酰胺环与碱作用水解，生成青霉噻唑酸，此步反应是定量进行的；其次青霉噻唑酸在酸性条件下，与过量且定量的碘液反应，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定液滴定，同时做空白试验。反应式如下：
通过大量实验发现，碘与青霉噻唑酸的反应以pH=4.5、温度在24～26℃、加碘放置15～20 min为最好。由于整个氧化过程受温度、溶液pH值和时间等诸多因素影响，消耗碘的量没有确定的化学计量关系，因此实验过程中要严格控制温度，同时采用与青霉素标准品平行测定的方法，以抵消上述各种因素的影响。另外，其他降解产物等杂质所消耗的碘量，可用未经水解的样品溶液做空白试验进行校正。
本法的优点是1 mol青霉素能消耗4 mol碘，故灵敏度较高，可用于浓度为10～100
g/mL供试液的测定；当采用标准品进行对照时，碘量法所测得的结果与微生物检定法基本一致。因此常规质量控制中许多国家已用碘量法取代微生物检定法测定青霉素总量。但当供试液浓度低于10
g/mL时，测得结果不如微生物检定法可靠。
《中国药典（2000年版）》中注射用普鲁卡因青霉素的含量测定方法：精密称取本品约0.12 g，置100 mL容量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置碘瓶中，加1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，放置20 min，再加1 mol/L盐酸溶液1 mL与醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=4.5）5 mL，精密加入碘滴定液（0.01 mol/L）15 mL，密塞，摇匀，在20～25℃暗处放置20 min，用硫代硫酸钠滴定液（0.01 mol/L）滴定，至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5 mL，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=4.5）5 mL，精密加入碘滴定液（0.01 mol/L）15 mL，密塞，摇匀，在暗处放置20 min，用硫代硫酸钠滴定液（0.01 mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素标准品同法测定作对照，算出供试品的含量。
（3）汞量法：青霉素族药物分子与汞盐不发生反应，但其在碱性条件下的完全水解产物青霉胺与汞盐能发生定量反应，根据消耗的汞盐量可计算青霉素的含量。其测定原理是：青霉素族药物分子中的氢化噻唑环含有一个硫原子，水解开环后形成巯基，与汞盐定量发生反应。其反应式为
《中国药典（2000年版）》中青霉素钠的含量测定方法：取本品约50 mg，精密称定，加水5 mL溶解后，加1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，摇匀，放置15 min，加1 mol/L硝酸溶液5 mL，醋酸盐缓冲液（pH=4.6）20 mL及水20 mL，摇匀，照电位滴定法，用铂电极作为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在35～40℃，用硝酸汞滴定液（0.02 mol/L）缓慢滴定（控制滴定过程约为15 min），不计第1个等当点，计算第2个等当点时消耗滴定液的量。每1 mL硝酸汞滴定液（0.02 mol/L）相当于7.128 mg的总青霉素（按C16H17N2NaO4S计算）。
另取本品约0.5 g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25 mL，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液（0.02 mol/L）滴定。滴定终点判断方法同上。每1 mL硝酸汞滴定液（0.02 mol/L）相当于7.128 mg降解物（按C16H17N2Na O4S计算）。每1 mg的C16H17N2NaO4S相当于1 670单位青霉素。
总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素钠的百分含量。
用汞盐滴定青霉素的水解液时，在滴定曲线上会出现2个滴定突跃，计算青霉素的含量时应以第2次滴定终点为依据，此时青霉素与巯基汞化物的物质的量之比为1∶1。测定过程中要注意必须保证青霉素水解完全，若水解不完全，会使测定结果偏低。溶液的pH值和反应时间将直接影响水解的完全程度，因此应严格控制反应时间和溶液的pH值。
本法专属性强，与碘量法相比，不需使用青霉素标准品，汞盐的滴定液可用EDTA标准溶液进行标定。
（4）紫外-可见分光光度法：
1）酸水解-铜盐法：青霉素族分子的β-内酰胺环在紫外光区无吸收，但它在弱酸性条件下的水解产物青霉烯酸，与Cu2+作用形成较稳定的螯合物，在320 nm波长处有最大吸收，可用于青霉素族药物的定量分析。
2）羟肟酸盐比色法：青霉素族和头孢菌素族抗生素能与羟胺作用生成羟肟酸衍生物，该衍生物在稀酸中与Fe3+能形成红色配位化合物，可通过在一定波长下测定配位化合物的吸光度进行定量分析。
3）硫醇汞盐法：在咪唑的催化下，青霉素族抗生素与氯化汞的中性溶液（pH=6.8）于60℃能定量反应生成相应的青霉烯酸硫醇汞盐，该硫醇汞盐在324～345 nm波长范围内有最大吸收。反应式如下：
《中国药典（1995年版）》中氨苄西林的含量测定方法：取本品约50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置另一100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，加硼酸缓冲液（取硼酸1.24 g，加水180 mL溶解后，加氢氧化钠试液调节pH值至9.0，再用水稀释至200 mL）2.5 mL与醋酐的乙腈溶液（1→50）0.25 mL，放置5 min后，加咪唑溶液（取用苯精制过的咪唑8.25g，加水60 mL溶解后，加6 mol/L盐酸溶液8.3 mL，在搅拌下滴加0.27%氯化汞溶液10 mL，调节pH值至6.8±0.05，用水稀释至100 mL，滤过）至刻度，摇匀，置60℃水浴中，加热30 min，取出，冷却，照分光光度法，在325 nm的波长处测定吸收度，另取氨苄西林三水合物对照品，按同法测定，计算，即得。
硫醇汞盐法专属性强，操作简便，易于掌握；生成的青霉烯酸硫醇汞盐可稳定3 h以上；使用对照品进行对照，重现性较好，相对标准偏差在1%以内。