二、无菌检查法
活菌进入人体内会导致剧烈的反应，引起并发症，甚至危及生命。在药品制备或加工过程中，受药物性质的限制，有时不能进行可靠的高压、热压灭菌处理，而采取间歇灭菌、除菌过滤及无菌操作等技术，因此法定无菌制剂必须进行严格的无菌检查后才能用于临床。《中国药典》规定注射剂；眼用制剂；用于手术、创伤或临床必须无菌的鼻用制剂；用于烧伤或严重创伤的软膏剂与乳膏剂、涂膜剂；供雾化器用的液体制剂；用于烧伤、严重创伤或临床必须无菌的喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、局部用散剂；植入剂；用于手术、耳部伤口或耳膜穿孔的滴耳剂与洗耳剂；冲洗剂等，均需进行无菌检查。
无菌检查法系用于检查《中国药典》要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法，可用于判断供试品在检验条件下是否被微生物污染。常用的无菌检查方法是将药品或材料，在严格的无菌操作条件下，接种于适合各种微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养一定的时间，逐日观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否染菌。无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种两种方法。
（一）常规技术要求
（1）应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求。
（2）检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
（3）单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。
（二）培养基
无菌检查需按照《中国药典》规定选择适合需氧菌、厌氧菌或真菌生长的培养基。培养基可按规定处方制备，也可使用按规定处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基避光保存于2～25℃，试验前需做适用性检查。
1.培养基的种类 《中国药典》无菌检查法规定的培养基有7种，包括硫乙醇酸盐流体培养基（需氧菌、厌氧菌培养基）、胰酪大豆胨液体培养基（真菌、需氧菌培养基）、中和或灭活用培养基、0.5%葡萄糖肉汤培养基（用于硫酸链霉素等抗生物的无菌检查）、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基。
2.培养基的适用性检查 硫乙醇酸盐流体培养基及胰酪大豆胨液体培养基等在供试品的无菌检查进行前或检查的同时，应做适用性检查，包括无菌性检查及灵敏度检查。检查合格后方可进行无菌检查方法验证试验和供试品的无菌检查。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品无菌检查同时进行。
（1）无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），培养14 d，应无菌生长。
（2）灵敏度检查：用以证明在做药物的无菌检查时，所加的菌种能够在培养基中生长良好。适用性检查的菌种有金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲霉。培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证验证菌株的生物学特性。
方法：按照《中国药典》规定的方法分别制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌液。取每管装量为12 mL的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu（菌落形成单位）的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3 d；取每管装量为9 mL的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100 cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5 d。逐日观察。
结果判定：在规定的培养条件下，空白对照管应无菌生长，若加菌培养基管均生长良好，判定培养基对细菌的灵敏度检查符合规定。
（三）方法适用性试验
在进行药物的无菌检查前，需要先进行方法验证，以确认该方法适合于供试品的无菌检查，即需要先测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用，避免假阴性结果。该方法的菌种及操作同培养基灵敏度测定法。对于具有抑菌作用的供试品，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或灭活剂。如β-内酰胺酶、对氨基苯甲酸，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行，进行过无菌检查法方法验证的供试品，方可进行无菌检查。
（四）试验过程
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。
无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
1.检验数量及检验量 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。检验量是指一次试验所用供试品总量（g或mL）。除另有规定外，供试品的检验数量和检验量可按照《中国药典》四部通则中列出“批出厂产品及生物制品的原液和半成品最小检验数量”“上市抽验样品的最少检验数量”和“供试品的最少检验量”三个表格中的规定取量检验。
2.对照试验 供试品在做无菌检查的同时还需做对照试验，包括阳性对照和阴性对照。
（1）阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌。无抑菌作用和抗革兰氏阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备方法同方法适用性试验。对照菌在规定的培养条件下培养72 h，要求阳性对照必须长菌，且对照菌应生长良好。阳性对照试验用以证明微生物确实可在应用的试验条件下生长。
（2）阴性对照：取试验所用的相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。用以检查试验过程中使用的溶剂、表面活性剂、灭活剂、中和剂、稀释液等对微生物生长及存活无影响。要求阴性对照必须不长菌。
3.检查方法
（1）薄膜过滤法：适用性广，准确性强，适合于任何类型的药品，尤其适用于具有抑菌作用的供试品。该法通过滤膜过滤，将供试品中可能存在的微生物富集于滤膜上，再冲洗掉滤膜上的抑菌成分后，在薄膜过滤器滤筒内加入培养基，在所需温度下培养，观察是否有菌生长。
一般采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般的薄膜过滤器。滤膜孔径应不大于0.45
m，直径约50 mm。不同类型的供试品，过滤操作的方法有所不同。应根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
（2）直接接种法：操作简便，适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。该法按照规定量，将每支（或瓶）供试品分别等量接种至含有硫乙醇酸盐流体培养基及胰酪大豆胨液体培养基中，按照规定温度培养14 d；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置30～35℃培养，一份置20～25℃培养。逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现混浊，培养14 d后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3 d，观察是否再出现混浊；或取培养液涂片、染色、镜检，判断是否有菌。
4.无菌检查结果判断
（1）若供试品管显澄清，或虽显混浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定。
（2）若供试品管中任何一管显混浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。
（3）当无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求或回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素时，可判试验无效。试验若经确认无效，需依法重试。