四环素类抗生素的分析

四、四环素类抗生素的分析

四环素类抗生素分子结构中都具有四并苯或萘并萘环，故统称为四环素类抗生素，包括盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸金霉素等。

（一）化学结构与性质

1.典型药物 四环素类抗生素可以看作是四并苯或萘并萘的衍生物，其基本结构如下：

结构中各取代基R、R′、R″、R′′′的不同构成了各种不同的四环素类抗生素（表6-16），其共同结构特点是母核上含有以下官能团：C2位上的酰胺基，C4位上的二甲氨基，C10位上的酚羟基，有2个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。

表6-16　四环素类药物的取代基

（续表）

2.性质

（1）酸碱性与溶解度：本类抗生素的母核上C4位上的二甲氨基[—N（CH3）2]显弱碱性；C10位上的酚羟基（—OH）和2个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统（式中虚线内所示部分）显弱酸性，故四环素类抗生素是两性化合物。遇酸及碱均能生成相应的盐，临床上多应用盐酸盐。

这类抗生素是结晶性物质，具引湿性。其盐酸盐易溶于水，并溶于碱或酸性溶液中，而不溶于三氯甲烷、乙醚等有机溶剂。四环素类抗生素的游离碱在水中的溶解度很小，其溶解度与溶液的pH值有关，在pH=4.5～7.2之间时难溶于水；当pH值高于8或低于4时，水中溶解度增加。其盐类在水中会水解，当溶液浓度较大时，会析出游离碱。

（2）旋光性：四环素类抗生素分子中具有不对称碳原子，因此有旋光性，可用于定性、定量分析。各国药典测定该类抗生素的比旋度，如《中国药典》规定盐酸土霉素在盐酸（9→1 000）溶液中的比旋度为-188°～-200°；盐酸四环素的比旋度为-240°～-258°（1.01 mol/L盐酸溶液）。盐酸多西环素的比旋度为-105°～-120°[盐酸溶液（9→1 000）的甲醇溶液（1→100）]。

（3）紫外吸收和荧光性质：本类抗生素分子内含有共轭双键系统，在紫外光区有吸收，如《中国药典》中盐酸多西环素的甲醇溶液在269 nm和353 nm的波长处有最大吸收，在234 nm和296 nm的波长处有最小吸收；盐酸美他环素的水溶液在345 nm、282 nm和353 nm的波长处有最大吸收，在264 nm和222 nm的波长处有最小吸收。

（4）稳定性：

1）还原性：干燥的四环素类游离碱及其盐酸盐比较稳定，但在储存过程中遇光颜色会变深，这和空气中氧气的氧化作用有关。四环素类抗生素对酸、碱和各种氧化剂都是不稳定的。

2）差向异构化：四环素在弱酸性（pH=2.0～6.0）溶液中，A环中手性碳原子C4的构型转变，发生差向异构化，形成4-差向四环素。该反应为可逆反应，达到平衡时溶液中差向四环素的含量可达40%～60%。四环素和金霉素很容易发生差向异构化，产生4-差向四环素和4-差向金霉素，使其抗菌活性减弱或完全消失。差向异构化的速度与多种因素有关，当pH＜2或pH＞9时差向异构化速度很小，而某些阴离子如磷酸根、枸橼酸根、醋酸根离子的存在，可加速差向异构化反应的进行。土霉素、多西环素和美他环素由于C5上的羟基和C4上的二甲氨基形成分子内氢键，因此较稳定，C4上不易发生差向异构化。

3）降解反应：

A.酸性降解：四环素在酸性较强的溶液中（pH＜2），特别是在加热情况下，极易产生脱水四环素。C环中C6上有羟基的其他四环素类抗生素，如金霉素、土霉素在同样情况下也能发生降解反应，生成脱水物。在脱水四环素和脱水金霉素的分子中，共轭双键的数目增加，因此色泽加深，对光的吸收程度增强。橙黄色的脱水金霉素或脱水四环素，分别在435 nm和445 nm波长处有最大吸收。此性质可作为对金霉素和四环素进行比色测定的依据。

B.碱性降解：四环素类抗生素在碱性溶液中，C环破裂，生成无活性的具有内酯结构的异四环素，后者在紫外光照射下，显强烈荧光。其他在C环中C6上有羟基的四环素类抗生素，如金霉素、土霉素在同样情况下也能发生降解反应，生成异四环素类。

半合成的四环素类药物，如米诺环素，由于C6上没有羟基，不发生降解反应，因此性质较稳定。

（5）与金属离子的反应：四环素类抗生素类药物分子中含有许多羟基、烯醇基和羰基，在近中性条件下能与多种金属离子形成有色配位化合物。

（二）盐酸四环素的质量分析

1.性状 本品为黄色结晶性粉末；无臭，味苦；略有引湿性；遇光色渐变深，在碱性溶液中易破坏失效；在水中溶解，在乙醇中微溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶；比旋度为-240°～-258°。

2.鉴别

（1）三氯化铁反应：取本品约0.5 mg，加硫酸2 mL，即显深紫色，再加三氯化铁试液1滴，溶液变成红棕色。

原理：四环素类药物的分子结构中具有酚羟基，遇三氯化铁试液立即呈色。例如，盐酸四环素呈红棕色；盐酸金霉素呈深褐色；盐酸土霉素呈橙褐色；盐酸多西环素呈褐色。

（2）高效液相色谱法鉴别：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

原理：《中国药典》采用高效液相色谱法鉴别盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸金霉素等。

（3）红外光谱法鉴别：本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。

（4）本品的水溶液显氯化物鉴别（1）的反应。

原理：供试品溶液加硝酸使成酸性后，加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀。

3.检查

（1）有关物质：临用新制。取本品，加0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.8 mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取2 mL，置100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液2 mL，置100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度溶液。照含量测定项下的色谱条件试验，量取灵敏度溶液10L注入液相色谱仪，记录色谱图，主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10。再精密量取供试品溶液与对照溶液各10L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，土霉素、4-差向四环素、盐酸金霉素、脱水四环素、差向脱水四环素按校正后的峰面积（分别乘以校正因子1.0、1.42、1.39、0.48和0.62）分别不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%）、1.5倍（3.0%）、0.5倍（1.0%）、0.25倍（0.5%）、0.25倍（0.5%），其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（1.0%）。供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰面积的峰忽略不计。

原理：盐酸四环素的有关物质主要是指在生产和储存过程中易形成的异构杂质、降解杂质等。这些杂质的存在不仅使抗菌活性降低，还会使有些患者出现恶心、呕吐、糖尿、蛋白尿及中毒等急性或亚急性毒副反应。《中国药典》均采用高效液相色谱法控制四环素类抗生素的有关物质。

四环素类抗生素中的有关物质主要是指在生产和储存过程中易形成的异构杂质、降解杂质（ETC、ATC、EATC）等。《中国药典》、USP32-NF27和BP2010均采用HPLC法控制四环素类抗生素中的有关物质。

（2）杂质吸收度：取本品，在20～25℃时，加0.8%氢氧化钠溶液制成每毫升中含10 mg的溶液，照紫外-可见分光光度法，置4 cm的吸收池中，自加0.8%氢氧化钠溶液起5 min后，在530 nm的波长处测定，吸光度不得过0.12（供注射用）。

原理：四环素类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，如差向四环素为淡黄色，因其不稳定易变成黑色；脱水四环素为橙红色；差向脱水四环素为砖红色。因此，《中国药典》规定了在一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸收度的限量。

四环类抗生素多为黄色结晶性粉末；而异构体、降解产物颜色较深，如差向四环素为淡黄色，因其不稳定又易变成黑色；脱水四环素为橙红色；差向脱水四环素为砖红色。此类杂质的存在均可使四环素类抗生素的外观色泽变深。因此《中国药典》均规定了一定溶剂、一定浓度、一定波长下杂质吸光度的限量。

讨论：测定530 nm波长处的吸光度是用以控制碱性降解物的含量。在测定时，温度越高，加氢氧化钠溶液后放置的时间越长，则吸光度越高，故应严格控制温度和时间。

4.含量测定 照高效液相色谱法测定。

（1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸铵溶液[0.15 mol/L醋酸铵溶液-0.01 mol/L乙二胺四醋酸二钠溶液-三乙胺（100∶10∶1），用醋酸调节pH值至8.5]-乙腈（83∶17）为流动相；检测波长为280 nm。取4-差向四环素对照品、土霉素对照品、差向脱水四环素对照品、盐酸金霉素对照品及脱水四环素对照品各约3 mg与盐酸四环素对照品约48 mg，置100 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液10 mL使溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，取10L注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序为：4-差向四环素、土霉素、差向脱水四环素、四环素、金霉素、脱水四环素，四环素峰的保留时间约为14 min。4-差向四环素峰、土霉素峰、差向脱水四环素峰、四环素峰、金霉素峰间的分离度均应符合要求，金霉素峰与脱水四环素峰间的分离度应大于1.0。

（2）测定法：取本品约25 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取10L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取盐酸四环素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

（三）四环素类药物的其他分析方法

1.化学鉴别法

（1）浓硫酸反应：四环素类抗生素遇硫酸立即产生颜色，不同的四环素类药物具有不同的颜色，以此可区别各种四环素类抗生素。四环素类药物与硫酸反应后的颜色变化如表6-17所示。

表6-17　四环素类药物与硫酸反应后的颜色

（2）荧光反应：四环素类抗生素分子结构中含有2个共轭系统，在紫外光照射下能产生荧光，它们在酸性或碱性条件下的降解产物也具有荧光特性，可供鉴别不同的四环素类抗生素。土霉素经酸降解后，在紫外光照射下呈现绿色荧光；经碱降解后，在紫外光照射下呈现绿色荧光，加热，荧光变为蓝色；金霉素经碱降解后在紫外光照射下呈现蓝色荧光；四环素经碱降解后呈现黄色荧光。

2.仪器分析鉴别法

（1）紫外分光光度法：本类抗生素分子内含有共轭双键体系，在紫外光区有吸收，因此《中国药典》将紫外吸收特征作为盐酸多西环素的鉴别项目。

盐酸多西环素的鉴别方法：取盐酸多西环素供试品适量，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中含20g的溶液，照紫外-可见分光光度法测定，在269 nm和354 nm的波长处有最大吸收，在234 nm和296 nm的波长处有最小吸收。

（2）薄层色谱法：薄层色谱法的设备简单、操作方便，分离效果也较好，因此部分四环素类抗生素采用薄层色谱法进行鉴别和杂质检查。

《中国药典》中盐酸土霉素的鉴别：取本品与土霉素对照品，分别加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中约含1 mg的溶液，作为供试品溶液与对照品溶液；另取土霉素与盐酸四环素对照品，加甲醇溶解并稀释制成每1 mL中各约含1 mg的混合溶液，照薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各lL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以水-甲醇-二氯甲烷（6∶35∶59）溶液作为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视，混合溶液应显2个完全分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的位置和荧光应与对照品溶液主斑点的位置和荧光相同。