五、中药指纹图谱
中药指纹图谱（traditional Chinese medicine fingerprint）系中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标定该中药材或中药制剂特性的共有峰的图谱，即运用现代分析技术对中药化学信息以图形（图像）的方式进行表征并加以表述。中药指纹图谱是一种现代中药鉴别新技术，是一种综合的、可量化的鉴定手段，是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性，能提供从原药材的种植、栽培、引种，中成药生产过程中工艺的规范与优化，到产品质量标准的制订，全方位的质量保证。因此，中药指纹图谱为研究道地药材、稀有药材替代品以及原药材真伪鉴别的依据。
目前，指纹图谱技术是在现有的技术条件下对中药材、中成药进行质量控制最好的解决办法。现代分析技术包括光谱、色谱、波谱、核磁共振、X-射线衍射等和各种连用技术。
（一）中药指纹图谱的特点
中药指纹图谱是一种综合的、量化的鉴别手段。整体性和模糊性为其显著特点。①整体性，是指把所得指纹图谱作为一个整体进行考察，而不能以其中单个峰的有无、峰的高低，以及峰面积的大小来判断检测品的质量。②模糊性，是指个体样品本身存在着差异，难以精确地进行测量，绝大多数指纹图谱本身也存在着模糊性，不能保证所得的指纹图谱中每一个峰都没有重叠，而且也不能保证所得的图谱包含了样品的所有特征，况且在不同的实验条件下得到的图谱会有很大的差异。但是，只要能圈定图谱中关键部分即可对样品进行质量控制。因此，中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术，更可以发展成为一种采用各种指纹图谱来进行中药理论（复杂系统）和新药开发的研究体系和研究模式。
（二）建立中药指纹图谱的原则及意义
1.建立中药指纹图谱的原则 中药指纹图谱的建立，要以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，应遵循以下三个原则。
（1）系统性：指纹图谱反应的化学成分应包括中药所含大多数组分的类别或全部指标成分。如人参中的有效成分是人参皂苷，则在指纹图谱的考察中，应尽可能多地反映其中的皂苷成分；而对于有效成分较为复杂的，如银杏叶中的有效成分是黄酮和银杏内酯类，针对这两类成分其指纹图谱可采用两种方法进行分析，最终达到系统、全面的目的。
（2）特异性：指纹图谱是中药自身的“化学条码”，其反映的化学信息（表现为保留时间或比移值）具有高度的选择性，通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别区分中药的真伪、优劣或产地。
（3）重现性（可操作性）：是指对于已建立的指纹图谱，不同的操作者，在不同的实验室中，只要在规定的方法和条件下、允许的误差范围内，都能做出相同的结果，这样才能保证指纹图谱的通用性和实用性。
2.建立指纹图谱的意义 指纹图谱是对中药质量控制的补充和提高。理想中的指纹图谱不仅能进行定性鉴别，也可用于精确的定量分析。通过指纹图谱研究，可以掌握每个批次原药材、中间体成分的变化，进行有指导的合理“混批勾兑”，保证成品在成分含量、组成比例上保持一致，减少批间差异。
（三）中药指纹图谱的类型
狭义的中药指纹图谱是指中药化学（成分）指纹图谱；广义的中药指纹图谱则通常按测定手段和应用对象的不同进行分类。
1.按测定手段分类 中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学（成分）指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范（SOP）、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。
2.按应用对象分类 中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段。按应用对象来分类，可分为中药材（原料药材）指纹图谱、中药原料药（包括饮片、配伍颗粒）指纹图谱和中药制剂指纹图谱。再细分，还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。值得注意的是，建立中药材化学指纹图谱必须考虑诸多因素的影响。中药品种混杂，历史上形成的同名异物、异名同物，以及同一物种受产地环境、不同有效部位所含成分波动较大等因素，给质量控制带来了很多困扰。因此对于某一种中药材的指纹图谱，需要有大量的数据积累，才能制定合理的相似性标准。
（四）中药色谱指纹图谱研究的技术关键
1.研究思路与内容
（1）确定研究对象：一种药材有多个临床应用，有多种活性组分。研究中药注射剂的指纹图谱时，必须尽可能详尽地了解药材、中间体和成品中所含成分的种类及其理化性质，找出成品中的药效成分或有效成分，作为成品及中间体指纹图谱的研究对象，即分析检测目标。
（2）研究内容：中药注射剂在固定中药材品种、部位、产地、采收期及加工工艺的前提下，需制订中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱。
2.研究方案
（1）样品的选择与收集：药材应尽可能固定产地（如道地药材）、采收期和炮制加工方法等，对工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少出现异常的药材批次应重点选择，另外还应收集不同产地、不同采收期的药材，中间体、注射剂的收集原则也应重点选择工艺稳定、疗效恒定、临床使用中很少出现异常的批次。
供试品的取样应按《中国药典》一部中规定的中药材取样方法，以保证所取供试品的代表性和均一性。
（2）供试品的制备：在指纹图谱研究过程中，供试品（中药材、中间体及注射剂）溶液的制备，应根据所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法须确保该注射剂、有效部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中的再现，以便分析指纹图谱的相关性。
注射剂中除少数品种添加溶剂外，所含化学成分均具有较好的水溶性，而且研究生产工艺时考虑到色素、生物大分子等因素，生产过程中已通过微孔滤膜、脱色等操作，无须特殊处理，可直接分析检测。
（3）参照物的制备：制订指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含化学成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物；如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行。
（4）研究方法的选择：根据所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材及其制剂，特别是中药复方注射剂，必要时可以考虑采用多种检测方法，建立多张指纹图谱。
（5）色谱条件的选择：无论是原药材、中间体，还是注射剂，其指纹图谱的色谱条件选择是整个研究检测方法过程中最重要、关键性的内容。下面以HPLC法为例，阐述各影响因素与解决途径。
1）色谱柱：指纹图谱研究时一般选择5～10
m的C18填充柱，以250 mm×4.6 mm较适宜，其他特殊填料的色谱柱，如氨基柱、氰基柱等，可视研究对象的不同进行选择。
2）流动相：流动相可选择乙腈、甲醇、水和四氢呋喃等。对于反相高效液相色谱法，乙腈-水系统比较适合梯度洗脱，而醇-水系统由于热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时易导致基线漂移。
3）检测器：HPLC法应用最多的是紫外检测器，且前主要是可变波长型和二极管阵列检测器，适用于在紫外区具有吸收物质的测定。蒸发光散射检测器适用于不含发色团物质的检测，如碳水化合物（多糖）、类脂类（磷脂）、皂苷等，可与紫外检测器互相补充。联用技术中质谱检测器是最有效的检测手段，如GC-MS，HPLC-MS等可提供大量的结构信息，符合解决中药复杂体系的要求。
检测波长的选择：中药制剂根据君、臣、佐、使的组方理论，在尽可能兼顾佐、使药的同时，主要选择君、臣药中有效成分的吸收峰值；一个检测波长的色谱图如达不到控制质量的目的时，可建立多个检测波长下的指纹图谱。
4）柱温：柱温的选择与恒定是影响指纹图谱技术稳定性的主要因素之一。当色谱图中某个色谱峰因溶解度差而峰形较钝时，可适当提高柱温（30～50℃）；若样品中组分在常温或高温下不稳定，易发生水解或分解（如乌头生物碱）等变化时，可降低柱温。
5）进样量：进样量对指纹图谱的结果影响不大，但加大进样量，可以减弱梯度洗脱时基线漂移的程度；然而色谱柱的载样量有一定的限度，进样量过大，色谱柱超载，导致色谱峰峰宽增加或色谱峰峰尖钝化，并影响柱的寿命。
（6）指纹特征的选择与技术参数：指纹图谱方法一旦建立，除提供指纹图谱外，还应说明相应的技术参数。通过大样本的指纹图谱内在的挖掘，找出其中的指纹特征是指纹图谱研究的目的。
1）共有指纹峰的标定：采用色谱法制订指纹图谱，必须根据参照物的保留时间，计算指纹峰的相对保留时间。根据10批次以上供试品的检测结果，标定共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰。
2）共有指纹峰面积的比值：以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。
A.中药材供试品的图谱中，各共有峰面积的比值与指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，单峰面积占总峰面积大于或等于20%的共有峰，其差值不得大于±20%；单峰面积占总峰面积大于或等于10%，而小于20%的共有峰，其差值不得大于±25%；单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。
B.注射剂及其有效部位或中间体供试品的图谱中，各共有峰面积的比值与指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，保留时间小于或等于30 min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于或等于20%的共有峰，其差值不得大于±20%；单峰面积占总峰面积大于或等于10%，而小于20%的共有峰，其差值不得大于±25%；单峰面积占总峰面积大于或等于5%，而小于10%的共有峰，其差值不得大于±30%；单峰面积占总峰面积小于5%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30 min的共有峰：单峰面积占总峰面积大于或等于10%的共有峰，按上述规定执行；单峰面积占总峰面积小于10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。
C.非共有峰面积：中药材供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的10%。注射剂及其有效部位或中间体供试品的图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5%。
总之，指纹图谱研究的建立、分析、比较、评价和校验，应逐渐取得共识并形成规范。指纹图谱研究应结合当前的实际情况，同时还应该结合生产工艺的优选及药效和临床观察，当前阶段宜简不宜繁、宜易不宜难，以确保研究方法与产品质量的基本稳定和一致。
知识链接
HPLC法对不同产地12批白花蛇舌草药材的指纹图谱研究
精密称取白花蛇舌草样品1.0 g，置125 mL圆底烧瓶中，加入体积分数80%的甲醇20 mL，超声提取40 min，取上清液用微孔滤膜（0.45
m）过滤，即得供试品溶液。
色谱条件为Thermo BetaBasie-18（250 mm×4.6 mm，5
m）为色谱柱；柱温：30℃；以乙腈0.5%醋酸为流动相，连续梯度洗脱；体积流量1.0 mL·min-1；检测波长为360 nm；进样量10
L.注入高效液相色谱仪，记录色谱图（图6-9）和各色谱峰保留时间（图6-9、图6-10），以面积归一化法计算各色谱峰相对峰面积（AR）。
图6-9 白花蛇舌草药材标准色谱指纹图谱
图6-10 12批白花蛇舌草药材色谱图