对氨基苯甲酸酯类药物的分析
《中国药典》收载的本类药物主要包括苯佐卡因、盐酸普鲁卡因、盐酸丁卡因、盐酸普鲁卡因胺等。本类药物苯环上多具有芳伯氨基或同时具有脂烃胺侧链，故其游离碱多为碱性油状液体或低熔点固体，难溶于水，易溶于有机溶剂；其盐酸盐多为白色结晶性粉末，具有一定的熔点，易溶于水和乙醇，不溶于乙醚。
（一）药物结构与性质
1.典型药物 本类药物分子结构中均含有对氨基苯甲酸酯母核，其基本结构为
典型药物结构如下：
2.主要性质
（1）水解性：分子结构中含酯键（或酰胺键），易水解，可用于鉴别。
（2）芳香第一胺反应：可用于鉴别和含量测定。
（3）弱碱性：除苯佐卡因外，脂烃胺侧链为叔胺氮原子，具有弱碱性，可用于鉴别（生物碱沉淀剂反应）和含量测定（非水溶液滴定法）。
（4）羟肟酸铁反应：盐酸普鲁卡因胺分子中具有芳酰胺结构，加入浓过氧化氢溶液，缓缓加热至沸后，先被氧化成羟肟酸，再与三氯化铁作用形成配位化合物羟肟酸铁，其溶液显紫红色，随即变为暗棕色至棕黑色。此性质可用于鉴别。
（5）紫外吸收性：本类药物分子结构中含有苯环，具有紫外特征吸收，可用于鉴别和含量测定。
（二）盐酸普鲁卡因的分析
1.性状 本品为白色结晶或结晶性粉末；无臭，味微苦，随后有麻痹感。本品在水中易溶，在乙醇中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醚中几乎不溶。本品的熔点为154～157℃。
2.鉴别
（1）取本品约0.1 g，加水2 mL溶解后，加10%氢氧化钠溶液1 mL，即生成白色沉淀；加热，变为油状物；继续加热，产生的蒸气能使湿润的红色石蕊试纸变为蓝色；热至油状物消失后，放冷，加盐酸酸化，即析出白色沉淀。
注释：普鲁卡因分子结构中含有酯键（或酰胺键），容易水解。水解的快慢受光线、温度或碱性条件的影响，利用水解产物的性质，可以对化合物进行鉴别。向其水溶液加10%氢氧化钠溶液后，即析出普鲁卡因的白色沉淀；加热，游离的普鲁卡因呈油状物；继续加热，则分解释放出二乙氨基乙醇的碱性气体，能使润湿的红色石蕊试纸变为蓝色；加热至油状物消失后（生成可溶于水的对氨基苯甲酸钠），放冷，加盐酸酸化，即析出对氨基苯甲酸的白色沉淀。
（2）本品的水溶液显氯化物的鉴别反应。
1）取供试品溶液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸银试液，即生成白色凝乳状沉淀；分离，沉淀加氨试液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀又生成。如供试品为生物碱或其他有机碱的盐酸盐，须先加氨试液使成碱性，将析出的沉淀滤过除去，取滤液进行试验。
2）取供试品少量，置试管中，加等量的二氧化锰，混匀，加硫酸湿润，缓缓加热，即发生氯气，能使用水湿润的碘化钾-淀粉试纸显蓝色。
（3）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。
3.检查
对氨基苯甲酸检查：
（1）高效液相色谱法（《中国药典》）：取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，作为供试品溶液；另取对氨基苯甲酸对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含1
g的溶液，作为对照品溶液；取供试品溶液1 mL与对照品溶液9 mL混合均匀，作为系统适用性溶液。照高效液相色谱法试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.1%庚烷磺酸钠的0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（68∶32）为流动相；检测波长为279 nm。取系统适用性溶液10
L，注入液相色谱仪，理论板数按对氨基苯甲酸峰计算不低于2 000，普鲁卡因峰和对氨基苯甲酸峰的分离度应大于2.0。精密量取对照品溶液与供试品溶液各10
L，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与对氨基苯甲酸峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.5%。
（2）薄层色谱法（《中国药典》）：精密量取本品，加乙醇稀释使成为每1 mL中含盐酸普鲁卡因2.5 mg的溶液，作为供试品溶液。取对氨基苯甲酸对照品，加乙醇制成每1 mL中含30
g的溶液，作为对照品溶液。取上述两种溶液各10
L，分别点于含有羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，用苯-冰醋酸-丙酮-甲醇（14∶1∶1∶4）为展开剂，展开后，取出晾干，用对二甲氨基苯甲醛溶液（2%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液100 mL，加冰醋酸5 mL制成）喷雾显色。供试品溶液如显与对照品溶液相应的杂质斑点，其颜色与对照品溶液主斑点比较，不得更深。
注释：普鲁卡因分子结构中有酯键，易发生水解反应。其注射液制备过程中受灭菌温度、时间、溶液pH值、贮藏时间，以及光线和金属离子等因素的影响，可发生水解反应生成对氨基苯甲酸和2-二乙氨基醇。其中对氨基苯甲酸随贮藏时间的延长或高温加热，可脱羧、氧化为有色物，使注射液变黄。已变黄的注射液不仅疗效下降，而且毒性增加。故《中国药典》规定盐酸普鲁卡因及其注射液须检查水解产物对氨基苯甲酸。《中国药典》从2010年版起采用操作简单、结果准确性较高的高效液相色谱法。
此外，普鲁卡因原料药还要进行酸度、溶液的澄清度、干燥失重、炽灼残渣、铁盐、重金属等一般杂质的检查项目。
4.含量测定
（1）亚硝酸钠滴定法。普鲁卡因原料药测定（《中国药典》）：取本品约0.6 g，精密称定，照永停滴定法，在15～25℃，用亚硝酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1 mL亚硝酸钠滴定液（0.1 mol/L）相当于27.28 mg的C13H20N2O2·HCl。
注释：
1）原理：分子结构中具芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物，在酸性溶液中可与亚硝酸钠反应生成重氮盐，可用亚硝酸钠滴定法测定含量。
2）测定条件：重氮化反应的速度受多种因素的影响，亚硝酸钠及重氮盐均不稳定，而且重氮化反应速度慢，因此在测定中应注意以下条件：
A.溴化钾的作用：滴定液中加入适量溴化钾，可加快重氮化反应速度。溴化钾与盐酸作用产生氢溴酸，亚硝酸与氢溴酸作用生成亚硝酰溴，使被测溶液中NO+的浓度增大，加速重氮化反应。
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B.酸的种类与量：常用者为过量盐酸。
3）分析讨论：
A.重氮化反应的速度在氢溴酸溶液中最快，在盐酸溶液中次之，在硫酸或硝酸溶液中最慢。而氢溴酸价格较贵，其次芳香胺类药物的盐酸盐的溶解度较其硫酸盐大，故常用者仍为盐酸。
B.在实际测定时需加入过量盐酸的目的：①重氮化反应速度加快。②酸度增高能增加重氮盐的稳定性。③防止生成偶氮氨基化合物。酸度不足时已生成的重氮化合物可与尚未被重氮化的芳胺偶合，生成偶氮氨基化合物，影响测定结果。
酸度加大，反应向左进行，故可以防止偶氮氨基化合物的生成。但酸度不可过高，否则将引起亚硝酸的分解，也会抑制芳伯氨基的游离，使重氮化反应速度变慢。所以，酸的实际用量通常都为理论值的2.5～6倍。
C.滴定温度：重氮化反应速度随温度的升高而加快，一般温度每升高10℃，重氮化反应速度加快2.5倍，但所形成重氮盐亦随温度的升高而迅速分解：
滴定温度过高亦促使亚硝酸逸失和分解：
所以滴定应在低温下进行。但低温时反应速度缓慢。经试验，可在室温（10～30℃）条件下采用“快速滴定法”。
D.滴定方式：滴定时将滴定管尖端插入液面下2/3处快速滴定。
重氮化反应为分子反应，反应速度较慢，所以滴定速度不宜过快。但为了避免滴定过程中亚硝酸挥发和分解，滴定时将滴定管尖端插入液面下2/3处，一次将大部分亚硝酸钠滴定液在搅拌条件下迅速加入，使其尽快反应。然后将滴定管尖端提出液面，用少量水冲洗尖端，再缓缓滴定，尤其是在近终点时，因尚未反应的芳香第一胺药物的浓度极稀，须在最后一滴加入后，搅拌1～5 min，再确定终点是否真正到达。这样可以缩短滴定时间，也不影响结果。
E.指示终点的方法：指示终点的方法有电位法、永停滴定法、外指示剂法、内指示剂法等。《中国药典》多采用永停法，其装置如图6-1所示，《美国药典》采用电位滴定法。
图6-1 永停滴定仪的装置图
a.永停滴定法：即用两个相同的铂电极，在两个电极间加一低电压（约为50 mV），并串联一个微电流计，电极浸在被滴定液中，用亚硝酸钠溶液滴定时，终点前，线路上无电流或仅有很小的电流流过微电流计，所以指针指零；当到达终点时，溶液中有微量亚硝酸存在，使电极去极化，发生氧化还原反应：
此时线路中即有电流通过，电流计指针突然偏转，不再回零，即为滴定终点。永停滴定法装置简单，方法准确简便。缺点是电极易钝化，临用前可用浓硝酸（加有1～2滴三氯化铁试液）温热活化。
b.外指剂法：常用碘化钾-淀粉糊剂或指示液，滴定到达终点时，稍过量的亚硝酸钠在酸性溶液中氧化碘化钾，析出的碘遇淀粉即显蓝色。使用时，将糊剂在白瓷板上铺为薄层，当以细玻璃棒蘸取少量测定液划过，立即显蓝色，即为终点。
以碘化钾-淀粉作外指示剂的方法，适用于多种药物及其制剂的亚硝酸钠滴定法。亚硝酸钠液（0.1 mol/L）在过量1～2滴（0.05～1 mL）时，可灵敏地指示终点。但由于被滴定溶液的酸性强，未达到终点时，碘化钾在酸性条件下遇光被空气氧化可游离出碘，与淀粉显蓝色，而混淆终点。而多次外试，也会损失供试品而增加误差，所以初次使用者较难掌握。有时须预先计算标准溶液的消耗量，在接近理论终点前，再缓缓滴定和取测定液试验终点，如此可减少供试品损失。
碘化钾-淀粉指示液易变质，临用时须新鲜配制。
《中国药典》等版本对盐酸普鲁卡因、注射用盐酸普鲁卡因、苯佐卡因、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普鲁卡因胺片的含量测定均采用此法。2005年版也采用本法测定盐酸普鲁卡因注射液含量，2010版起改为高效液相色谱法测定。
（2）高效液相色谱法：
《中国药典》盐酸普鲁卡因注射液测定方法：
1）色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.1%庚烷磺酸钠的0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0）-甲醇（68∶32）为流动相；检测波长为290 mn，理论板数按普鲁卡因峰计算不低于2 000。普鲁卡因峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。
2）测定法：精密量取本品适量，用水定量稀释制成每1 mL中含盐酸普鲁卡因0.02 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取10
L注入液相色谱仪，记录色谱图；另取盐酸普鲁卡因对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中含盐酸普鲁卡因0.02 mg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。