水杨酸类药物的分析
《中国药典》收载的本类药物有消毒防腐药（水杨酸）、解热镇痛药（阿司匹林和贝诺酯）和抗结核病药（对氨基水杨酸钠）等。本类药物多为白色结晶或结晶性粉末，除对氨基水杨酸钠易溶于水外，其他药物在水中微溶或几乎不溶，能溶于乙醇、乙醚及三氯甲烷等有机溶剂。
（一）药物结构与性质
1.典型药物 典型药物结构如下：
2.主要性质
（1）酸性：该类药物的酸性来源于苯环上的羧基及酚羟基。水杨酸类药物的酸性受苯环、羧基及取代基的影响。取代基为甲基、氨基时能增加苯环电子云密度从而降低氧氢键极性，使酸性较苯甲酸弱；反之，取代基为卤素、硝基、羟基时能降低苯环上电子云密度，使羧基中羟基氧原子的电子云密度降低，从而增加氧氢键极性，较易离解出质子，故酸性较苯甲酸强。这一性质可用于本类药物的鉴别和含量测定。
（2）芳香第一胺反应：对氨基水杨酸钠的结构中具有芳伯氨基，在酸性条件下，与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生产的重氮盐与碱性β-萘酚发生偶合反应，生成橙红色沉淀。这一性质可用于鉴别和含量测定。
（3）水解性：阿司匹林和贝诺酯的结构中具有酯键，无游离羧基，且在碱性条件下水解产生酚羟基和羧酸。
（4）三氯化铁反应：水杨酸和对氨基水杨酸钠的结构中具有酚羟基，可与三氯化铁试液作用生成有色的配位化合物，可用于鉴别。
（5）紫外吸收性：本类药物分子结构中含有共轭体系，具有紫外特征吸收，可用于鉴别和含量测定。
（二）阿司匹林的分析
1.性状 本品为白色结晶或结晶性粉末；无臭或略带乙酸味，味微酸；遇湿气即缓缓水解；在乙醇中易溶，在三氯甲烷或乙醚中溶解，在水或无水乙醚中微溶；在氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液中溶解，但同时分解。
2.鉴别
（1）三氯化铁反应：取本品约0.1 g，加水10 mL，煮沸，放冷，加三氯化铁试液1滴，即呈紫堇色。
注释：阿司匹林分子结构中无游离的酚羟基，不能直接与三氯化铁试液反应，但其水解产物水杨酸在中性或弱酸性（pH值为4～6）条件下可与三氯化铁试液反应，生成紫堇色配位化合物。
（2）水解产物反应：取本品约0.5 g，加碳酸钠试液10 mL煮沸2 min后，放冷，加过量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并发生醋酸的臭气。
注释：阿司匹林在碱性溶液中加热水解生成水杨酸钠及醋酸钠，放冷后用稀硫酸酸化，析出白色的水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。
（3）红外光谱法：阿司匹林分子中含有羟基、酯基及邻位取代苯环，它们都可在红外光谱中产生特征吸收峰。《中国药典》对阿司匹林进行红外鉴别，其红外吸收图谱应与对照的图谱一致。
3.检查
（1）游离水杨酸：
1）高效液相色谱法（《中国药典》）：临用新制。取本品约0.1 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液适量，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取水杨酸对照品约10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（通则0512）试验。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20∶5∶5∶70）为流动相；检测波长为303 nm。理论板数按水杨酸峰计算不低于5 000，阿司匹林峰与水杨酸峰的分离度应符合要求，立即精密量取对照品溶液与供试品溶液各10
L分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与水杨酸峰保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.1%。
2）高铁盐反应比色法[《中国药典（2005年版）》]：取本品0.10 g，加乙醇1 mL溶解后，加冷水适量使之成50 mL，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液[取盐酸溶液（9→100）1 mL，加硫酸铁铵指示液2 mL后，再加水适量使成100 mL]1 mL，摇匀，30 s内如显色，与对照液（精密称取水杨酸0.1 g，加水溶解后，加冰醋酸1 mL，摇匀，再加水使成1 000 mL，摇匀，精密量取1 mL，加乙醇1 mL、水48 mL，与上述新制的稀硫酸铁铵溶液1 mL，摇匀）比较，不得更深（1%）。
注释：该项检查系控制阿司匹林中的游离水杨酸的量。水杨酸对人体有毒性，其分子中所含的酚羟基易被氧化，在空气中被逐渐氧化成一系列醌型有色化合物（如淡黄、红棕甚至深棕色）而使成品变色，因而需加以控制。《中国药典》以高效液相色谱法代替原来与高铁盐反应比色法，防止反应中产生新的水杨酸。
（2）有关物质：取本品约0.1 g，置10 mL容量瓶中，加1%冰醋酸甲醇液适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量1 mL，置200 mL容量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；精密量取对照溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为灵敏度试验溶液。照高效液相色谱法（通则0512）试验。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20∶5∶5∶70）为流动相A，乙腈为流动相B，按表6-1进行线性梯度洗脱；检测波长为276 nm。阿司匹林峰的保留时间约为8 min，理论板数按阿司匹林峰计算不低于5 000，阿司匹林峰与水杨酸峰分离度应符合要求。分别精密度量取供试品溶液、对照品溶液、灵敏度试验溶液及水杨酸检查项下的水杨酸对照品溶液各10
L，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除水杨酸峰外，其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积（0.5%）。供试品溶液色谱图中任何小于灵敏度试验溶液主峰面积的峰可忽略不计。
表6-1 阿司匹林线性梯度洗脱
注释：自《中国药典（2010年版）》起，增加了对阿司匹林有关物质的检查，旨在控制阿司匹林中杂质的限量。
此外，阿司匹林原料药还要进行溶液的澄清度、干燥失重、炽灼残渣、重金属等一般杂质的检查项目。
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4.含量测定
（1）直接酸碱滴定法：阿司匹林原料药的测定（《中国药典》）：取本品约0.4 g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20 mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）滴定。每1 mL氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于18.02 mg的阿司匹林（C9H8O4）。
注释：
1）原理：阿司匹林分子结构中的游离羧基具有一定的酸性，与碱成盐，可用NaOH标准溶液在乙醇溶液中直接滴定测其含量。
2）测定条件：直接滴定法反应的速度受多种因素的影响，因此在测定中应注意以下条件：
A.阿司匹林具有酯的结构，为了增加供试品的溶解性，且防止阿司匹林酯结构在滴定时水解，致使测定结构偏高，故选用乙醇溶液溶解供试品进行滴定。
B.滴定时应在不断振摇下稍快地进行，以防止局部碱度过大而促使其水解，经试验，可在温度（0～40℃）条件下采用直接滴定法。
C.供试品中所含水杨酸超过规定限度时，不宜用直接滴定法测定。否则测定结果偏高。
D.指示终点的方法：因本品为有机酸，显弱碱性，用氢氧化钠滴定时，化学计量点偏碱性，故选用碱性区变色的酚酞作为指示剂。因乙醇对酚酞显微酸性，故乙醇在使用前需用氢氧化钠中和后使用。
《中国药典》（2015年、2010年、2005年版等版本）对水杨酸、双水杨酯原料药的含量测定均采用此法。
（2）两步滴定法：阿司匹林片中除了加入少量酒石酸或枸橼酸稳定剂外，制剂工艺过程中也可能有水解产物（水杨酸、醋酸）产生，它们均能消耗氢氧化钠，使测定结果偏高。因此不能采用直接滴定法，《中国药典（2005年版）》采用先中和供试品共存的酸，再将阿司匹林在碱性条件下水解后测定的两步滴定法。
1）步骤及原理：
A.第一步中和：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量（约相当于阿司匹林0.3 g），置锥形瓶中，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20 mL，振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）至溶液显粉红色。其反应式为
B.第二步水解与测定：在中和后的供试品溶液中，加定量过量的氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）40 mL，置水浴上加热15 min并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05 mol/L）回滴（滴定剩余的碱），并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于18.02 mg的C9H8O4。
反应式如下：
2）分析讨论：
A.第一步中和的目的：中和了存在的游离酸，阿司匹林同时成为钠盐。
B.加碱加热并时时振摇的目的：保证阿司匹林充分水解。
C.空白试验的目的：校正空气中二氧化碳带来的误差。
（3）高效液相色谱法：《中国药典》（2010年版、2015年版）对阿司匹林片剂的测定方法：照高效液相色谱法测定。色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃-冰醋酸-水（20∶5∶5∶70）为流动相；检测波长为276 nm。理论板数按阿司匹林峰计算不低于3 000，阿司匹林峰与水杨酸峰分离度应符合要求。取本品20片，精密称定，充分研细，精密称取细粉适量（约相当于阿司匹林10 mg），置100 mL容量瓶中，用1%冰醋酸的甲醇溶液强烈振摇使阿司匹林溶解，并用1%冰醋酸的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤膜滤过；精密量取溶液10
L，注入液相色谱仪，记录色谱图。另取阿司匹林对照品适量，精密称定，加1%冰醋酸的甲醇溶液振摇使溶解并定量稀释制成每1 mg中约含0.1 mg的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。