（一）母种制作
1.培养基配方
母种培养基与羊肚菌母种的分离培养有密切关系。这里收集各地科研部门经过试验筛选的几种配方，供选用。
（1）马铃薯200克，葡萄糖20克，硫酸铵2克，蛋白胨1克，硫酸镁1克，磷酸二氢钾1克，水1000毫升，pH6.5～7（华南师范大学生物系张松等，2001）。
（2）豆芽200克（煮汁），葡萄糖20克，琼脂20克，硫酸镁0.3克，磷酸二氢钾1.5克，维生素B110毫克，水1000毫升，pH6.5（四川绵阳食用菌研究所朱斗锡等，2008）。
（3）马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.3克，维生素B110毫克，水1000毫升，pH6～7（陕西生物科学与工程学院李树森等，2008）。
（4）黄豆芽200克（煮汁），麦麸200克，腐殖土100克（悬浮液），玉米粉50克，蔗糖20克，琼脂20克，水1000毫升，pH6～7（长白山真菌研究所王绍余，2009）。
（5）阔叶树木屑400克，黄豆粉100克，蔗糖20克。
（6）酵母膏1克，玉米粉100克，麦麸40克，蔗糖20克。
（7）苹果50克，蛋白胨1克，蔗糖20克。
以上配方（4）～（7）四种配方均另加磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克，琼脂20克，水1000毫升，pH自然（沈阳大学农学系杨绍彬、牛志涛等设计）。
（8）黄豆芽500克，白糖20克，琼脂20克，羊肚菌基脚土50克。
（9）黄豆芽500克，白糖20克，琼脂20克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克。
（10）马铃薯200克，白糖20克，蛋白胨0.5克，牛肉膏0.5克。
（11）蛋白胨1克，白糖20克，琼脂20克，酵母膏1克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁1克。
（12）杨树木屑500克，白糖20克，琼脂20克。
上述（8）～（12）五种配方，由吉林农垦特产高等专科学校唐玉芹、赵义涛设计。
（13）小麦50克，苹果渣50克（煮汁），磷酸二氢钾2克，葡萄糖20克，硝酸钾0.1克，氯化钾0.5克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.01克，琼脂20克，水1000毫升，pH7～7.5（李峻志等，2001）。
2.配制方法
同常规。
3.母种分离
分离方法有以下三种。
（1）孢子分离法采集的羊肚菌种菇，表面可能带有杂菌，要用75%的酒精擦洗2～3遍，然后再用无菌水冲洗数次，用无菌纱布吸干表面水分。分离前还要进行器皿的消毒。把烧杯、玻璃罩、培养皿、剪刀、不锈钢钩、接种针、镊子、无菌水、纱布等，一起置于高压灭菌器内灭菌。然后连同酒精灯和75%酒精或0.1%升汞溶液，以及装有经过灭菌的琼脂培养基的三角瓶、试管、种菇等，放入接种箱或接种室内进行一次消毒。
孢子采集可分整朵插种菇、三角瓶钩悬等方法。操作时要求在无菌条件下进行。
①整菇插种法：在接种箱中，将经消毒处理的整朵种菇，插入无菌孢子收集器里，再将孢子收集器置于适温下，让其自然弹射孢子（图3-4）。
②三角瓶钩悬法：将消过毒的种菇，用剪刀剪取拇指大小的菇盖，挂在钢钩上，迅速移入装有培养基的三角瓶内。菇盖距离培养基2～3厘米，不可接触到瓶壁，随手把棉塞塞入瓶口。为了便于筛选，一次可以多挂几个瓶子。
图3-4 钟罩法采集分离伞菌类孢子
1.种菇 2.孢子采集装置 3.孢子印 4.孢子悬浮液 5.用接种环蘸取孢子液在平板上划线 6.孢子萌发 7.移入试管培养基内培养
（2）组织分离法组织分离法属无性繁殖法。它是利用羊肚菌子实体的组织块，在适宜的培养基和生长条件下分离培养纯菌丝的一种简便方法（图3-5）。
（3）基内分离法在野外采集羊肚菌种菇的地面，挖取基质含腐殖物土壤，除去附着物，提取其中粗壮、新鲜的菌丝夹，清水洗净，晾干；在无菌条件下，用无菌水反复冲洗、纱布吸干后，用接种针钩取菌丝夹先端的一小块，移接入试管斜面或培养皿的培养基上，在25℃条件下培育。
图3-5 羊肚菌组织分离示意图
以上各分离法均可提纯培育出母种。
4.接种培养
将分离的母种按常规接入配制好的斜面培养基上，每支母种可接10～15支试管，母种只能扩繁一次，不能多接或多扩，更不能传代，否则影响子实体生长。接种后置18℃～22℃下避光培养，7天左右可长满斜面培养基，如不及时使用，需放入冰箱在0℃～3℃下保存，时间最长不得超过半年。