（五）菌种制作
1.母种制作
（1）培养基配方母种培养基配方有以下几种。
①鲜松针100克（水煮过滤），麦芽汁100毫升，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.15%，葡萄糖2%，维生素B110毫克，琼脂2%，水900毫升，pH5～5.5（张林，1992）。
②蛋白胨2克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升（李崇安，1994）。
③马铃薯200克，葡萄糖20克，蛋白胨1克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁1克，维生素B110毫克，琼脂20克（王文耀等，2008）。
以上任选一方，按常规配制斜面培养基备用。
（2）母种分离方法 牛肝菌纯种分离常采用组织分离法，选择野生未成熟的子实体为分离材料，采后1～2小时进行分离。分离时，从子实体取一小块组织，接在培养基上，在24℃条件下培养。
（3）接种培养 接种后，在20℃～25℃恒温下培养7天后，菌丝逐渐变得浓密，呈白色，绒毛状，15天长满试管斜面提纯培育可得母种。
2.原种和栽培种制作
牛肝菌原种和栽培种适用天然有机物培养基。其配方为阔叶树木屑78%，麦麸20%，蔗糖1%，石膏粉1%，另加维生素B10.01%，料水比1∶1.2，pH调至6。
培养基配制与其他菌类对比，要求较为严格，操作过程中应注意以下几点。
（1）场地选择 以水泥地和木板坪为好。泥土地因含有土沙，加水后泥土溶化会混入料中，不宜采用。选好场地后进行清洗，并清理四周环境，防止污染。
（2）过筛除杂 先把木屑、麦麸等主要原料、辅料，分别用2～3目的竹筛或铁丝网过筛，剔除小木片、小枝条及其他有棱角的硬物，以防装料时刺破塑料袋。
（3）区别混合 先将木屑、麦麸、石膏粉搅拌均匀，棉籽壳提前12小时加水预湿；然后把可溶性的添加物，如蔗糖等溶于水，再加入料中混合。
（4）加水搅拌 采用自动搅拌机时，将料混合集堆，拌料机开堆，搅拌、反复运行，使料均匀。手工搅拌必须采取集堆，开堆，反复搅拌3～4次，使水分被原料均匀吸收。如果选用棉籽壳配方，应提前一天加水，使水分渗透到棉籽壳中。然后过筛打散结团，过筛时应边洒水，边整堆，防止水分蒸发。
（5）避免酸变 常因拌料时间延长，培养料发生酸变，接种后菌袋成品率不高。因此，当干物质加水后，从搅拌至装袋开始，其时间不超过2小时为妥。这就要分秒必争，当天拌料，及时装袋灭菌，避免基质酸变。
（6）控制污染 培养料灭菌后，冷却至常温，按无菌操作接入母种或原种，按常规培养，菌丝长满瓶（袋），即为原种或栽培种。