（三）母种的制作
1.斜面培养基的制备
（1）培养基配方
①PDA培养基：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，琼脂10～20克，水1000毫升pH6.2～6.5。
②PDA综合培养基：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH 6.2～6.5。
③PKYA综合培养基：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，酵母粉2克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH6.2～6.5。
④PYA综合培养基：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，蛋白胨2克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH6.2～6.5。
⑤木屑综合培养基：马铃薯（去皮）200克，阔叶树木屑100克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH6.2～6.5。
⑥麦麸综合培养基：马铃薯（去皮）200克，麦麸50～100克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH6.2～6.5。
⑦玉米粉综合培养基：马铃薯（去皮）200克，玉米粉50～100克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂10～20克，水1000毫升，pH6.2～6.5。
⑧保藏菌种培养基：马铃薯（去皮）200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B1微量，琼脂10～25克，水1000毫升，pH6.4～6.8。
（2）配制方法培养基配方虽然各异，但配制方法基本相同，都要经过如下程序：原料选择→称量调配→调节pH→分装→灭菌→摆成斜面。
①原料选择：最好不使用发芽的马铃薯，若要使用，必须挖去芽眼，否则芽眼处的龙葵碱对菌丝生长有毒害作用。木屑、麦麸、玉米粉等要新鲜不霉变、不生虫。否则昆虫的代谢产物和霉菌产生的毒素对菌丝也有毒害作用。
②称量：培养基配方中标出的“水1000毫升”不完全是水，实际上是将各种原料溶于水后的营养液容量。配制时要准确称取配方中的各种原料，配制好后使总容量达到1000毫升。
③调配：将马铃薯、木屑、麦麸、玉米芯等加适量水于铝锅中煮沸20～30分钟，用2～4层纱布过滤取汁；将难溶解的蛋白胨、琼脂等先入滤汁加热溶解，然后加入葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁等，用玻棒不断搅拌，使其均匀。如容量不足可加水补足至1000毫升。
④调节pH：不同菇菌类生长发育的最适pH不同，不同地区、不同水源的pH也不尽相同。因此对培养基的pH需要根据所生产母种的品性来调节。通常选用pH试纸测定已调配好的培养基，方法是将试纸浸入培养液中，取出与标准比色板比较变化了的颜色，找到与比色板上色带相一致者，其数值即为该培养基的pH。如果pH不符合所需要求，过酸（小于7），可用稀碱，如氢氧化钠或碳酸氢钠溶液调整；若过碱（大于7），则用稀酸，如柠檬酸、乙酸溶液调整。
⑤分装：将调节好pH的培养基分装于玻璃试管中，试管规格为（18～20）厘米（长）×（18～20）毫米（口径）。新启用的试管，要先用稀硫酸液在烧杯中煮沸以清除管内残留的烧碱，然后用清水冲洗干净，倒置晾干备用，切勿现洗现用，以免因管壁附有水膜，导致培养基易在试管内滑动。分装试管时可使用漏斗式分装器，也可自行设计使用倒“U”字形虹吸式分装器。分装时先在漏斗或烧杯中加满培养基，用吸管先将培养基吸至低于烧杯中培养基液面，然后一手管住止水阀，另一手执试管接流下来的培养基，达到所需量时，关闭止水阀（或自由夹）。如此反复分装完毕。分装时尽量避免流出的培养基沾在管口或壁上，如不慎沾上，要用纱布擦净，以免培养基粘住棉塞而影响接种和增加污染几率。试管装量一般为试管高度的1/5～1/4，不可过多，也不可过少（图5-7）。
图5-7 斜面培养基制作流程
分装完毕盖上棉塞。用干净的普通棉花，做成粗细均匀，松紧适度的棉塞，以塞好后手提时不掉为宜。棉塞长度以塞入试管内1.5～2.0厘米，外露1.5厘米左右为宜。然后10支试管捆成一捆，管口用牛皮纸或防潮纸包紧入锅灭菌。
（3）灭菌将捆好的试管放入高压灭菌锅内灭菌。先在锅内加足水，将试管竖立于锅内，加盖拧紧，然后接通热源加热。由于不同型号的高压锅内部结构不完全相同，所以，操作时要严格按有关产品说明进行，以免发生意外。加热时，当压力达到0.1～0.11兆帕开始计时，保持30分钟即可。灭菌完毕后，待压力降至零后打开排气阀排尽蒸汽，然后开盖，取出试管，趁热摆成斜面。其方法是在平整的桌面上放一根0.8～1.0厘米厚的木条，将灭好菌的试管口向上斜放在木条上。斜面的长以不超过试管总长度的1/2为宜，冷却凝固后即成斜面培养基。取出斜面试管10～20支，于28℃下培养24～48小时，检查灭菌效果，如斜面无杂菌生长，方可作斜面培养基使用。
2.菌种的分离
（1）母种的选择母种可引进或以自选的优良菌株进行分离，珍稀品种最好引进。
（2）母种的分离母种的分离可分孢子分离法、组织分离法和菇木分离法三种方法。
①孢子分离法：孢子分离有单孢分离和多孢分离两种，不论哪种均需先采集孢子，然后进行分离。
A.种菇的选择和处理选用菇形圆整、健壮、无病虫害、七八成熟、性状优良的单生菇子实体作为种菇，去除基部杂质，放入接种箱中，用新洁尔灭或75%的乙醇进行表面消毒。
B.采集孢子采集孢子的方法很多，最常用的有整菇插种法、孢子印法、钩悬法和贴附法。下面以整菇插种法为例，具体介绍其采孢及分离方法。（图5-8）
选取菌盖4～6厘米的子实体，切去菌柄，经表面消毒后插入下面有培养皿的孢子收集器内。盖上钟罩，让其在适温下自然弹射孢子，经1～2天，就有大量孢子落入培养皿内。然后将孢子收集器移入无菌箱中，打开钟罩，去掉种菇，将培养皿用无菌纱布盖好，并用透明胶或胶布封贴保存备用。
图5-8 钟罩法采集分离伞菌类孢子
C.接种将培养基试管、注射器、无菌水等器物用0.1%的高锰酸钾溶液擦洗后放入接种箱内熏蒸消毒，半小时后进行接种操作。打开培养皿，用注射器吸取5毫升无菌水注入盛有孢子的培养皿中，轻轻摇动，使孢子均匀地悬浮于水中。把培养皿倾斜置放，因饱满孢子比重大，沉于底层，这样可起到选种的作用。用注射器吸取下层孢子液2～3毫升，然后再吸取2～3滴无菌水，将孢子液进一步稀释；注射器装上长针头，针头朝上，静置数分钟后推去上部悬浮液，拔松斜面试管棉塞，沿试管壁插入针头，注入孢子液1～2滴，让其顺试管斜面流下，抽出针头，塞紧棉塞，放置好试管，使孢子均匀分布于培养基斜面上。
D.培养接种后将试管移入25℃左右的恒温箱中培养，经常检查孢子萌发情况及有否杂菌污染。在适宜条件下，3～4天培养基表面就可看到白色星芒状菌丝。一个菌丝丛一般由一个孢子发育而成，当菌丝长到绿豆大小时，从中选择发育匀称、生长迅速、菌丝清晰整齐的单个菌落，连同一层薄薄的培养基，移入另一试管斜面中间，在适温下培养，即得单孢子纯种。
有些菇是异宗结合的菌类，如平菇，单孢子的培养物不能正常出菇，必须要两个可亲和性的单孢萌发的单核菌丝交配而形成双核菌丝才具结实性。
E.孢子纯化分离：采集到的孢子不经分离直接接于斜面上也能培育出纯菌丝，但在菌丝体中必然还夹杂有发育畸形或衰弱及不孕的菌丝。因此，对采集到的孢子必须经过分离优选，然后才能制作纯优母种。分离方法有以下两种。
a.单孢分离法：所谓单孢分离，就是将采集到的孢子群单个分开培养，让其单独萌发成菌丝而获得纯种的方法。此种方法多用于研究菌菇类生物特性和用于遗传育种，直接用于生产上较少，这里不予介绍。
b.多孢分离法：所谓多孢分离，就是把采集到的许多孢子接种在同一斜面培养基上，让其萌发和自由交配，从而获得纯种的一种制种方法。此法应用较广，具体做法可分斜面划线法、涂布分离法及直接培养法。下面介绍前两种分离法。
斜面划线法：将采集到的孢子，在接种箱内按无菌操作规程，用接种针粘取少量孢子，在PDA培养基上自下而上轻轻划线接种（不要划破培养基表面）。接种后灼烧试管口，塞上棉塞，置适温下培养，待孢子萌发后，挑选萌发早、长势旺的菌落，转接于新的试管培养基上再行培养，发满菌丝即为纯化母种。
涂布分离法：用接种环挑取少量孢子至装有无菌水的试管中，充分摇匀制成孢子悬浮液，然后用经灭菌的注射器或滴管吸取孢子悬浮液，滴1～2滴于试管斜面或平板培养基上，转动试管，使悬浮液均匀分布于斜面上；或用玻璃刮刀将平板上的悬浮孢子液涂布均匀。经恒温培养萌发后，挑选几株发育匀称、生长快的菌落，移接于另一试管斜面上，适温培养，长满菌丝即为纯化母种。
以上分离出的母种，必须经过出菇试验，取得生物学特性和效应等数据后，才能确定能否应用于生产。千万不可盲从！
②组织分离法：即采用菇体组织（子实体）分离获得纯菌丝的一种制种方法，这是一种无性繁殖法，具有取材容易、操作简便、菌丝萌发早、有利保持原品种遗传性、污染率低、成功率高等特点。在制种上使用较普遍（图5-9）。具体操作如下。
图5-9 组织分离操作过程
挑选子实体肥厚、菇柄短壮、无病虫害、具本品系特征的七八成熟的鲜菇作种菇，切去基部杂质部分，用清水洗净表面，置于接种箱内。再将种菇放入0.1%的升汞溶液中浸泡1分钟，用无菌水冲洗数次，用无菌纱布吸干水渍，用经消毒的小刀将种菇一剖为二，在菌盖与菌柄相交处用接种镊夹取绿豆大小一块，移接在试管斜面中央，塞上棉塞，移入25℃左右培养室内培养。当菌丝长满斜面，查无杂菌污染时，即可作为分离母种。也可从斜面上挑选纯净、健壮、生长旺盛的菌丝进行转管培养，即用接种针（铲）将斜面上的菌丝连同一层薄薄的培养基一起移到新的试管斜面上，在适温下培养，待菌丝长满，查无杂菌，即为扩繁的母种（图5-10）。
图5-10 母种扩接操作过程
3.母种的扩繁与培养
为了适应规模化生产，引进或分离的母种，必须经过扩大繁殖与培养，才能满足生产上的需要。母种的扩繁与培养，具体操作方法如下。
（1）扩繁接种前的准备接种前一天，做好接种室（箱）的消毒工作。先将空白斜面试管、接种工具等移入接种室（箱）内，然后用福尔马林（每立方米空间用药5～10毫升）加热密闭熏蒸24小时，再用5%石炭酸溶液喷雾杀菌和除去甲醛臭气，使臭氧散尽后入室操作。如在接种箱内接种，先打开箱内紫外线灯照射45分钟，关闭箱室门，人员离开室内以防辐射伤人。照射结束后停半小时以上方可进行操作。操作人员要换上无菌服、帽、鞋，用2%煤酚皂液（来苏水）将手浸泡几分钟，并将引进或分离的母种用乙醇擦拭外部后带入接种室（箱）。
（2）接种方法 左手拿起两支试管，一般斜面试管母种在上，空白斜面试管在下，右手拿接种耙，将接种耙在酒精灯上烧灼后冷却。在酒精灯火焰附近先取下母种试管口棉塞，再用左手无名指和小指抽掉空白斜面试管棉塞并夹住，试管口稍向下倾斜，用酒精灯火焰封锁管口。把接种耙伸入试管，将母种斜面横向切成2毫米左右的条，不要全部切断，深度约占培养基的1/3。再将接种铲灼烧后冷却，将母种纵向切成若干小块，深度同前，宽2毫米，长4毫米。拔去空白试管的棉塞，用接种铲挑起一小块带培养基的菌丝体，迅速将接种块移入空白斜面中部。接种时应使有菌丝的一面竖立在斜面上，这样气生菌丝和基内菌丝都能同时得到发育。在接种块过管口时要避开管口和火焰接触，以防烫死或灼伤菌丝。将棉塞头在火焰上烧一下，然后立即将棉塞塞入试管口，将棉塞转几下，使之与试管壁紧贴。接种量一般每支20毫米×200毫米的试管母种可移接35支扩繁母种。
接种完毕，及时将接好的斜面试管移入培养室中培养。移入前，搞好室内卫生，用0.1%的来苏水或清水清洗室内及操作台面，并开紫外线灯灭菌30分钟。培养期间，室温控制在25℃左右，并注意检查发菌情况，发现霉菌感染，及时淘汰。待菌丝长满斜面即为扩繁母种。