基因克隆工具的研究

基因工程技术之所以能在体外将不同来源的DNA进行重新组合，构建新的重组DNA分子并在宿主细胞内扩增和表达，关键是借助了一系列重要的克隆工具，主要包括装载目的基因的载体系统、操作核酸分子的工具酶类及接受外源基因的受体系统。

（1）载体系统 载体是外源基因的运载工具，它能使携带的外源基因随自身DNA的复制而复制，或使外源基因插入、整合到宿主细胞的染色体上，随宿主DNA的复制而复制，并可启动目的基因在宿主细胞内完成转录。利用载体上特殊的选择标记，在相应的选择压力下，筛选阳性转化子的细胞克隆。目前已构建了数以千计的各类载体：原核载体和真核载体；克隆载体和表达载体；质粒载体、噬菌体载体、病毒载体及其他如YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色体）、PAC（P1 derived artificial chromosome，源于噬菌体P1的人工染色体）、BAC（bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体）等人工构建的载体。结构不断优化的载体分子，不仅简化了复杂的克隆操作程序，提高了转化效率，而且能装载的目的DNA片段可大至数千碱基对（kilo base pairs，kbp）。

（2）工具酶类 基因工程操作中必需的工具酶主要包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶及各种修饰酶。顾名思义，这些酶类是实施体外DNA切割、连接、修饰及合成等过程所需要的重要工具。限制性核酸内切酶可对DNA分子实施定点切割，且多数产生于便于连接的黏性末端。连接酶可通过催化磷酸酯键的形成，使不同来源的DNA片段相互连接。耐高温DNA聚合酶的发现使得DNA分子扩增的聚合酶链式反应（PCR）过程实现了程序化、自动化，成为使用领域最广的DNA扩增技术。

（3）受体系统 基因工程的受体与载体是一个严格配套、前后衔接的完整系统的两个方面。受体是载体及其携带的目的基因的宿主，是外源基因扩增和表达的场所。在真核生物宿主细胞内存在完成mRNA加工的酶系统，以确保外源目的基因的最终表达。受体的选择需根据工程设计的目的、转化所用的载体以及工程实施所采用的技术和方法而定。目前最常用的微生物受体系统是大肠杆菌受体系统和酵母受体系统，它们分别是原核与真核受体的典型代表。此外，还相继发展了链霉菌、芽孢杆菌、丝状真菌等受体系统。动物受体系统多为受精卵、干细胞以及乳腺组织、胚胎组织等。植物受体系统常用未成熟胚、愈伤组织或生长点、丛生芽等。