cDNA文库的构建
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对于真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列，采用电泳分离和杂交的方法都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA出发直接克隆目的基因的一个主要困难。
高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生约15 000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆要比直接从基因组克隆简单得多。
cDNA文库在研究某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤为：①mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。②cDNA第一条链的合成。③cDNA第二条链的合成。④双链cDNA的修饰。⑤双链cDNA的分子克隆。⑥cDNA文库的扩增。⑦cDNA文库的鉴定评价。
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面。
（1）获得起始RNA
构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05～0.5μg，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言的，起始RNA太少还是会或多或少地影响文库的构建和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则在总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。
（2）反转录
这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA，且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。
（3）层析柱cDNA分级
这一步稍不注意就会影响文库的构建或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其在加入cDNA之前要通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，加入和收集cDNA时要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用现做的透明薄胶检测，并根据检测结果舍弃太短的cDNA（一般400 bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。
噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率的高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆的连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10 kb以上，短的只有500 bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体连接在一起时，cDNA长度不同，连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。