CRISPR/Cas9系统在癌症中的应用
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。癌细胞的基因组非常复杂，含有多种基因突变，包括点突变、染色体重排、染色体增加或者减少等，这些突变最终导致了原癌基因激活或者抑癌基因失活，细胞生长失去控制。CRISPR/Cas9技术出现后，科学家们获得了强大的改造基因组的能力，可以用它制作各种基因突变的癌症模型，研究癌症发生的机制，筛选治疗药物；也可以直接用它编辑致癌基因或者致癌病毒，治疗癌症；还可以用它编辑免疫细胞，通过免疫细胞治疗癌症。
1.建立癌症的小鼠模型
小鼠是癌症研究中最常用到的动物模型。制作小鼠模型的传统方法是在小鼠胚胎干细胞中引入突变，然后将干细胞注射到胚囊中形成嵌合体小鼠，再经过一代才能获得纯合突变的小鼠。CRISPR/Cas9技术有效地提高了制作小鼠模型的效率。Jaenisch课题组用CRISPR/Cas9在小鼠胚胎干细胞中同时敲除了5个基因，随后他们将Cas9 mRNA和靶向Tet1和Tet2的sgRNA注射到小鼠受精卵中，建立了同时敲除两个基因的小鼠。
除了在小鼠胚胎干细胞和生殖细胞中实现了同时编辑多个基因，CRISPR/Cas9技术在小鼠体细胞中的编辑能力也毫不逊色。Ebert课题组用病毒介导的CRISPR/Cas9系统对小鼠的原代造血干细胞的多个基因进行编辑，成功建立了急性髓性白血病（AML）模型。有研究者在表达KrasG12D基因的肺癌小鼠模型中，利用CRISPR/Cas9对一系列人类肺癌可能的抑癌基因进行了功能筛查，并研究这些基因与原癌基因KrasG12D在肺癌发生和发展中的协同作用。2014年，Jacks课题组通过尾静脉注射CRISPR/Cas9质粒，在小鼠肝脏中破坏肿瘤抑制基因Pten和p53，制作出了产生肝脏肿瘤的小鼠模型，该技术产生的癌症小鼠和传统的Cre-loxp技术构建的小鼠具有相似的癌症表型。
在作体内编辑时，编码Cas9和sgRNA的DNA太大，用病毒包装效率很低。为了解决这个问题，张锋实验室将Cas9整合到Rosa26位点构建出了诱导型表达Cas9的小鼠（Cas9和CAG启动子之间有一段loxP-stop（33 polyA signal）-loxP序列阻止了Cas9的表达），再用组织特异性的启动子表达Cre重组酶，这样就可以去除干扰序列起始Cas9的表达。有研究者用AAV病毒将靶向KRAS、p53和LKB1基因的sgRNA的转导到Cas9小鼠的肺中，成功建立了小鼠肺癌模型。至此，科研工作者可以利用诱导表达Cas9的小鼠进行遗传操控，快速在体内建立癌症模型。
2.建立染色体重排的癌症模型
染色体重排指的是染色体片段位置的改变，包括染色体缺失、重复、倒位和异位。染色体重排有可能诱发细胞癌变，人类淋巴瘤和白血病就是染色体重排引起的。运用传统的方法制作染色体重排的癌症模型，需要在两个重排位点加上loxP序列，通过Cre-loxP重组制作染色体重排。运用CRISPR/Cas9技术产生染色体重排非常简单，只需要靶向切割两个重排位点就可以了。人类2号染色体重排会导致EML4-ALK融合表达，引发非小细胞肺癌。有研究者使用病毒介导的CRISPR/Cas9技术对成年小鼠体细胞进行编辑重排，快速地建立了EML4-ALK融合基因肺癌小鼠模型。随后又有研究者使用相似的技术制作了急性髓性白血病和尤文氏肉瘤染色体重排的癌症小鼠模型。这些模型为科学家深入研究癌症的发生机制以及在动物水平筛选抗肿瘤药物等提供了有效的平台。
3.高通量筛查与肿瘤细胞转移相关的基因
肿瘤发生是多个基因突变协同作用的结果，研究癌症面临的主要挑战是如何找出引发癌症的关键突变。2015年，张锋实验室和Sharp团队合作，运用CRISPR/Cas9文库对一个不具备转移能力的肺癌细胞系进行了高通量的单基因随机敲除，然后移植到免疫缺陷的小鼠中，其中一些细胞离开原有的位置随血管迁移形成了高转移性的肿瘤；通过对转移性肿瘤的sgRNA测序，筛查到了与癌症生成和转移相关的多个基因以及微小RNA（microRNA）。因此，CRISPR/Cas9文库技术为筛查引发癌细胞迁移的关键基因提供了新的思路。
4.癌症治疗
CRISPR/Cas9有两种方式用于治疗癌症，一种是直接攻击癌细胞中的关键基因，另一种是用于编辑免疫细胞，通过免疫细胞攻击癌细胞。我国科学家在膀胱癌细胞中制作了逻辑门控制的膀胱癌特异表达的Cas9和sgRNA系统，同时构建了LacI抑制蛋白控制表达的抑癌基因p21、E-cadherin和hBax的表达系统。在膀胱癌细胞中，CRISPR/Cas9将LacI敲除，抑癌基因得以表达，从而抑制了癌细胞的增殖和迁移，并导致了癌细胞凋亡。MCL1是一种抗凋亡蛋白，对人Burkitt淋巴瘤（BL）生存是必需的。Aubrey课题组用CRISPR/Cas9技术敲除了MCL1基因，导致了淋巴瘤细胞大量凋亡。一些病毒是导致癌症的罪魁祸首，例如Epstein-Barr病毒（EBV）感染会导致Burkitt淋巴瘤。利用CRISPR/Cas9敲除EBV可以显著地抑制肿瘤的增殖。CRISPR/Cas9在癌症治疗中最吸引人的一个应用是编辑CAR-T细胞，CAR-T细胞可以攻击肿瘤细胞。TALEN技术已经被用于编辑CAR-T细胞，消除HLA不匹配引发的免疫排斥。在NIH临床试验注册官网上搜索CRISPR，有10项与CRISPR/Cas9相关的临床试验，其中7项与治疗癌症相关。值得一提的是，我国四川大学华西医院开展了全球第一例应用CRISPR/Cas9技术的治疗肺癌的人体临床试验；中山医科大学附属第一医院开展了全球第一例应用CRISPR/Cas9技术清除体内HPV病毒，预防性治疗HPV诱发宫颈癌的临床试验。