五、反向PCR

反向PCR是一种用于研究与已知DNA区段相连接的未知DNA序列的PCR技术，因此，又可称为染色体缓移或染色体步移技术。PCR反应只能扩增两端序列已知的DNA片段，一般PCR两个引物的3′端是相对的，所以扩增的是两个引物中间的片段；而反向PCR的目的在于扩增两个引物旁侧的DNA片段，扩增得到的片段位于两个引物上游和下游。两个引物的3′端是朝相反方向的，故称反向PCR。

反向PCR的基本步骤：先用限制性内切酶对样品DNA进行酶切，然后用DNA连接酶把酶切产物连接成一个环状分子，通过已知序列设计引物进行反向PCR，扩增引物的上游片段和下游序列（图5-1）。

图5-1　反向PCR的基本步骤示意图

反向PCR的不足：第一，需要从许多限制内切酶中随机选择一种合适的酶，并且这个内切酶的识别位点序列不能存在于已知的序列中，即不能切断已知序列的DNAo酶切获得DNA片段大小要合适，片段太小则获得两端的未知序列太少，片段太大即使能连接成环状，也很难获得PCR扩增产物。第二，大多数真核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。所以往往需要两组到三组嵌套引物进行巢式PCR以提高准确度。第三，不能定向获得已知序列两端上下游的未知序列，有可能获得的序列大部分都是在已知序列的一端，而另一端获得很少。这就需要再筛选不同的内切酶，增加了工作量。

与反向PCR类似的染色体步移PCR技术还有接头PCR（cassette PCR）技术和锅柘PCR（panhandle PCR，P-PCR）技术。它们原理相似，只是在具体方法上有所不同。