巴斯德毕赤酵母表达系统

20世纪80年代，巴斯德毕赤酵母（以下简称“毕赤酵母”）曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100 g/L干重。其生长培养液包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源等组合，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX—甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的，其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导双重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。毕赤酵母中存在着一种被称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。合成的蛋白质储存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。

自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母作为宿主表达外源蛋白以来，作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越受到人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多。与其他表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势：

①含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

②表达水平高，既可在胞内表达，又可分泌型表达。在毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12 g/L，一般大于1 g/L。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；绝大多数外源基因在毕赤酵母中的表达水平比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。

③发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100 g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10 000 L。

④培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖。

⑤外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失。

⑥作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

毕赤酵母分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需具有引导分泌的信号序列。当然，利用外源蛋白本身的信号序列很方便，因为基因的全部编码序列可以插入表达载体的单个或多个克隆位点。但在许多实验中，毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功引导了几种外源蛋白的分泌，如鼠表皮生长因子，产量达0.45 g/L。