四、免疫PCR

免疫PCR（immuno PCR，Im-PCR）技术把抗原、抗体反应的高特异性和PCR反应的高灵敏性结合了起来，其本质是一种以PCR扩增一段DNA报告分子代替酶联反应来放大抗原、抗体结合率的改良型酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。免疫PCR是一种检测微量抗原的高灵敏度技术，是Sano等人在1992年开发的。

免疫PCR主要包括抗原—抗体反应、与嵌合连接分子结合和PCR扩增嵌合连接分子中的DNA（一般为质粒DNA）三个步骤。嵌合连接分子的制备是免疫PCR中最关键的环节。嵌合连接分子起着桥梁作用，它有两个结合位点，一个与抗原—抗体复合物中的抗体结合，另一个与质粒DNA结合。免疫PCR的基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在反应中形成抗原抗体—连接分子—DNA复合物，通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原。

免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样，主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原—抗体反应，同时又需要对固相结合的DNA进行扩增，因此，固相的选择应根据具体情况确定。如用微量板作为固相时，必须有配套的PCR仪来直接用微量板进行扩增，否则需要用PCR反应管作为固相。扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据PCR产物的大小选择凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果，再检测底片上PCR产物的光密度，并与标准品比较就可以得出待检抗原量。

免疫PCR的优点：①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上；②敏感度高，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，具有惊人的扩增能力，可用于单个抗原的检测；③操作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。