PCR的忠实性和致变性
1.PCR的忠实性
PCR的忠实性也称保真性，是指PCR反应的精确性，以其扩增产物中由DNA聚合酶诱导的碱基错配的频率来衡量，也称错配率。忠实性高表明由DNA聚合酶诱导的碱基错配少，反之则高。PCR的错配率在普通的PCR中不是那么突出，随着PCR的应用越来越广泛，特别用分析试剂盒进行诊断，一个碱基的改变都会引起结果的改变。因此，人们对PCR的忠实性有了更高的要求，并将其作为PCR中一个重要的研究课题。不同的DNA聚合酶有不同的PCR错配率特性（表5-1），如Taq DNA聚合酶没有3′—5′的外切酶活性的校正功能，所以在PCR中有较高的错配率。
表5-1 不同DNA聚合酶的错配率
除了与酶的种类有关，高浓度的dNTP或镁离子可降低忠实性，dNTP的浓度从200μmol/L降低到25～50μmol/L，或者Mg2+浓度为1.0mmol/L时可以提高PCR的忠实性；如果四种dNTP的浓度不同也会降低忠实性；进行较少的PCR循环有助于提高忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。
2.PCR的致变性
在正常的情况下人们需要的是PCR的忠实性，追求PCR的准确性尤为重要。但是在研究蛋白质和核酸的功能时，有时候我们希望得到突变体库，然后筛选得到具有特殊性质的个体，这时利用PCR的致变性就是一种很有效的手段。
如果需要突变的只是少数的碱基，可以用寡核苷酸引物来定点替换，但是当需要的突变分散在基因的全长中时，最好的办法是在PCR过程随机出现不正确掺入的现象。Taq DNA聚合酶的错配率为（0.1～2）×10-4/循环，20～25次循环后每个核苷酸产生的累积错误率达10-3，但对于构建一个具有不同序列的变异库是不够的，特别是对于小于1 kb的片段。因此，必须通过改变PCR的条件来提高PCR的致变性。
提高PCR中的dNTP浓度可以促进错误掺入；加入MnCl2、降低退火温度和延长退火时间可以降低PCR特异性，提高Taq DNA聚合酶酶量、增加Mg2+浓度提高酶活力和延长延伸时间，都有利于促进延伸链在碱基错配位置继续延伸，这些措施都可以提高PCR的致变性。
Mg2+浓度提高到7 mmol/L以上，dNTP浓度提高到1 mmol/L以上，添加Mn2+到0.5 mmol/L，提高Taq DNA聚合酶用量到正常的5倍以上，较低的退火温度、较长退火和延伸时间，可以使每一个碱基的错误率达到7×10-3。
在普通PCR条件下，具较大定向错配，即A—T对突变成G—C对，因此降低一种dNTP的量（约10%）、加入d ITP来代替被减少的dNTP或者提高dCT/dTTT到1 mmol/L，可以使PCR的致变性无倾向性。