酵母人工染色体（YAC）载体

YAC是目前能克隆最大DNA片段的载体，可插入100～2 000 kb的外源DNA片段。YAC是构建核基因组文库及基因作图的重要工具。将酵母染色体DNA的端粒、自主复制序列（autonomously replicatlng sequence，ARS）和着丝粒以及必要的选择标记基因序列克隆到大肠杆菌pBR322质粒中，构建成YAC克隆载体。此克隆载体的sup4基因内有一个可供外源DNA片段插入的克隆位点，在此位点酶切，能形成载体DNA的两条臂。

YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括1个复制起点序列、着丝粒和2个端粒。其中，TEL来源于四膜虫大核中rDNA分子的末端，定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解和重组，且能够稳定地复制。ARS是一段特殊的序列，含有酵母菌DNA进行双向复制所必需的信号，可保证YAC在酵母细胞中自主复制。CEN是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，可保证YAC在酵母细胞分裂时正确分配到子细胞中。

YAC载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、组氨酸合成缺陷型基因Trp1、His3，尿嘧啶合成缺陷型基因URA3等，以及赭石突变抑制基因Sup4。其中，Trp1和URA3基因分别是酵母色氨酸和尿嘧啶营养缺陷型Trp1-和URA3-的野生型等位基因，在相应的营养缺陷型酵母细胞中可作为选择标记，它们分别位于克隆位点的两侧，当有外源基因插入时，分别出现在YAC的左、右臂上，如果将YAC转入Trp1-和URA3-宿主菌后，则转化子能在选择培养基上生长。His3基因来源于酵母基因，在形成YAC克隆的过程中，可经BamH I酶切除去。Sup4基因为酵母细胞Trp-tRNA基因的一个赭石突变抑制基因，其上含有供外源DNA片段插入的克隆位点。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因Sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落的颜色转变，可筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。此外，YAC载体中还有来自pBR322质粒的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，可使YAC在大肠杆菌中复制和扩增以及便于筛选。

YAC载体功能强大，但有一些弊端，主要表现在三个方面：首先，在YAC载体中插入片段会出现缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个YAC中的插入片段由2个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆占总克隆的5%～50%。最后，YAC染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了YAC载体的广泛应用。YAC染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是YAC的一个突出的优点是，相较于大肠杆菌酵母细胞对不稳定的、重复的和极端的DNA有更强的容忍性。另外，YAC在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因较大，并且大多数结构基因具有多个外显子和多个内含子的结构，因此采用YAC载体可将较大的基因组片段转移到动物个体或动物细胞系中，以进行功能研究。