酵母表达系统的发展

真核基因和原核基因在结构上存在着很大的差别，原核生物的基因是连续的，真核生物的基因是间断的，即真核生物基因的编码区有内含子和外显子，翻译时要把内含子切除，形成只携带外显子遗传信息的成熟mRNA。真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，转录信号不同于原核生物的，大肠杆菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子。细菌的蛋白酶能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。由于真核基因在原核细胞中表达所产生的蛋白不足，而且没有真核转录后加工的功能，不能进行前体mRNA的剪接，所以在原核细胞中只能表达真核的cDNA而不能表达其基因组基因。由于原核细胞没有真核细胞翻译后加工的功能，蛋白不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构象折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性。由于真核基因在原核生物中表达的蛋白质经常是不溶的，当表达量超过细菌体总蛋白量10%时，就很容易形成包涵体。包涵体要经过复性，使其重新散开、重新折叠，才能成为具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质。复性是一件很困难的事情，也是蛋白质产业化的瓶颈，因此，采取的策略更多的是设计载体，使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。

尽管大肠杆菌表达系统有很多优点，但不是所有的基因，特别是真核生物基因都能在其中获得有效活性的表达，也没有一种表达系统能满足所有基因的表达要求。越来越多的真核基因被发现，其中多数基因功能不明，有些基因利用原核表达系统是无法获得具有天然生物活性的蛋白产物，特别是一些功能性膜蛋白、翻译后修饰的蛋白、分泌蛋白、多蛋白复合体以及带有抗原性或免疫原性的蛋白只能选择对应的真核表达系统，这都表明迫切需要发展新的真核表达系统。

真核生物基因表达和调控的复杂性远远超出我们的了解，因此发展多种真核表达系统在理论研究和实际工业化应用都具有非常重要的意义。真核表达系统具有完整翻译后的蛋白加工修饰体系，表达获得的重组蛋白更接近于天然蛋白质，它对真核生物基因的功能研究、真核生物的基因工程和基因治疗都起到重要的作用。

酿酒酵母是单细胞真核生物，它与人的生活和生产密切相关，没有致病性，具有和大肠杆菌一样容易的培养方式，又具有真核生物翻译后的修饰功能。所以酿酒酵母首先被用于构建真核表达系统。

自20世纪70年代开始，为了克服大肠杆菌表达系统表达真核基因的缺点，人们开始利用酵母进行表达系统的研究。1974年研究发现在大多数酿酒酵母中存在一种2μm质粒，这种质粒全长6.3 kb，在二倍体的细胞中存在60～100个拷贝，使得用酵母构建一种类似于大肠杆菌表达质粒的酵母表达质粒成为可能。1978年，酿酒酵母的Leu2营养缺陷型菌株成功构建，并用于酵母的转化和筛选，标志着酵母表达系统的成功建立。到1981年，人的α-干扰素在酵母中的成功表达，使酿酒酵母成为第一个成功表达外源基因的真核表达系统。1996年完成的酿酒酵母的全基因组测序，更为人类深入研究酵母打下了良好的基础。

酵母作为表达宿主的优势有：第一，酵母具有真核生物的特征，遗传背景清楚、稳定，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善。第二，酵母是一类种类繁多的生物资源，已知有80多个属约600多个种，数千个分离株。第三，有些酵母如酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母已经被人类用于食品生产并有几十年甚至上千年的历史，安全性高，有着成熟的发酵培养工艺。

与大肠杆菌相比，酵母作为外源蛋白表达宿主具有能高水平表达重组蛋白质、细胞能快速高密度生长、不需要抗生素等优点。但是，并不是所有类型的酵母都适合做基因表达的宿主，作为基因表达宿主需要具备一定的条件，如安全无致病性；有较清楚的遗传背景，容易进行分子操作，容易进行载体的导入；培养条件简单，容易进行高密度培养；有良好的蛋白质分泌能力，有类似高等真核的翻译后修饰功能等。

酵母细胞能够分泌表达多种蛋白质，那些能够被天然宿主分泌表达的蛋白质（如糖苷酶、血清白蛋白、细胞因子等）都容易在酵母中获得分泌表达。有实验表明，许多非分泌性蛋白能在不同类型的酵母细胞中实现分泌表达。因此，当不确定某种蛋白质的表达方式时，最好尝试分泌表达。

酵母表达系统是研究真核生物基因表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适用于有稳定表达功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统还具有操作简单、成本低廉、可大规模进行发酵的优点，是最理想的重组真核蛋白质生产制备工具。