阳性克隆子的筛选

阳性克隆子的筛选一般是指基因文库的筛选，需要从成千上万的转化子中筛选出含有目标序列的转化子，其筛选过程难度较大，因此要求有很高的筛选效率。

阳性克隆子筛选过程的难易程度，主要取决于所采用的基因克隆方案、载体类型以及目的基因的性质和来源。从文库中筛选目的基因的方法主要有表观筛选法、核酸杂交筛选法和免疫学检测法。

1.表观筛选法

表观筛选法是通过含有目的基因的转化子在平板培养基上产生特殊的表型变化来筛选阳性克隆子，其依据就是目的基因插入一定的载体后可以在大肠杆菌中表达，使平板上的菌落产生新的功能或性状，这样很容易通过形态学特征或者在平板培养基添加一定的功能检测底物区分出阳性克隆子。表观筛选法适合表达性的基因文库筛选，如原核生物的基因文库和cDNA文库等，表型特征一般是直接的或比较容易检测的生化酶学的特征，比如营养缺陷型相关基因、抗性基因和能在平板上呈现显色反应的基因等。表型筛选法对所使用的宿主有相应的要求：宿主不携带该种基因或为该基因的缺失突变体。

2.核酸杂交筛选法

当目标基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表达的真核生物的基因时，可以利用的可能只是该基因的部分序列，这样就只能以这段序列为核酸探针，用核酸杂交筛选法从基因文库筛选目的克隆。首先将平板上的菌落或者噬菌斑转移到硝酸纤维素滤膜上，经过裂解、变性、固定和封闭等一系列的前处理，再利用分子探针对文库进行原位杂交筛选，找到阳性信号点对应的克隆后再次验证。核酸杂交筛选法虽然操作较复杂，但其筛选效率高，通用性强，只要知道一段序列就可以采用，是应用最为广泛的阳性克隆子筛选方法。

3.免疫学检测法

免疫学检测法和核酸杂交筛选法类似，只是其使用的探针不是核酸，而是特异性的抗体。免疫学检测法适用于目的基因能在宿主细胞中表达且具有目的蛋白的抗体。该方法只能用于表达型的基因文库，通常是原核生物的基因组DNA文库和真核生物的cDNA表达文库，而且，所检测的对象为宿主中不编码的基因或宿主中缺失表达的基因。

总的来说，阳性克隆子的筛选没有固定、万能的实验方案，必须根据载体文库的种类、基因的性质、实验目的和技术平台等综合因素来确定筛选方案，如BAC或YAC等大片段的基因文库可以采用混合池PCR筛选法，因此在制订实验方案前，需要更多地参考他人的经验。