Ti质粒表达载体

利用T-DNA可携带外源DNA片段并整合到植物基因组的特性，经对天然Ti质粒的改造，构建用于植物遗传转化的表达载体，这类载体可分为一元载体和双元载体等类型。

1.一元载体

在载体结构中去除T-DNA区中的致瘤基因，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25 bp序列，造成T-DNA大段缺失可形成所谓卸甲的质粒，并在T-DNA上插入外源基因并不影响T-DNA的转移和整合功能。根据质粒的这一特性，最初开发的Ti质粒表达载体又称为共整合载体，其Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322 DNA所取代，但保留T-DNA的2个边界（RB和LB）序列。外源基因首先被克隆到pBR322中，然后把载有外源基因的重组载体（亦称中间载体）通过一定的方法（电击法、冻融法或三亲交配）导入农杆菌。由于改造的Ti质粒与导入的中间载体具有部分同源的pBR322序列而发生同源重组，外源基因因此整合到卸甲的Ti质粒的T-DNA区段，并与卸甲载体Ti质粒一起复制，形成一个共整合载体。利用中间载体上的抗性基因进行抗性筛选，即可筛选出发生了遗传重组的含目的基因的农杆菌用于植物转化。T-DNA的重组子进入植物细胞后可整合进植物基因组，利用植物选择标记基因筛选植物转化细胞并再生植株。简单来说，一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。由于该载体的T-DNA区与vir区紧密连锁，故也称为顺式载体。

2.双元载体

双元载体由2个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒构成。微型Ti质粒是含有T-DNA边界、缺失vir基因的Ti质粒，同时还带有目的基因、选择标记基因和多克隆位点以及大肠杆菌和农杆菌的复制起始位点。该质粒也称为大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒，但载体上不带vir，如图6-10所示的双元载体pBIN19。辅助Ti质粒含有T-DNA所必需的vir区段，它缺失或部分缺失T-DNA序列，其主要功能是表达毒蛋白，激活T-DNA转移。利用二元载体进行遗传转化时，首先要将外源基因构建到微型Ti质粒上，再将微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的土壤农癌杆菌菌株中，用该菌株侵染植物组织，含目的基因的T-DNA可整合到植物基因组中。双元载体不仅构建方便，而且其T-DNA整合进入植物细胞不需要带进许多冗余DNA序列，转化效率高于一元载体。

在双元载体的基础上，通过在微型Ti质粒载体上再引入1个含virB、virC和virG区段，连同原有辅助Ti质粒，这个系统中共有2个vir区段，具有更强的激活T-DNA转移的能力，这种改进的双元载体称为超级双元载体。这种载体系统现多用于单子叶植物的转化。

图6-10　双元载体pBIN19示意