T4多聚核苷酸激酶对DNA的修饰作用
商品化的T4多聚核苷酸激酶是来源于T4噬菌体的基因由大肠杆菌表达纯化得到的，同时具有激酶和磷酸酯酶两种活性。其激酶活性在分子的C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近。
T4多聚核苷酸激酶的激酶活性是，可以催化ATP的γ-位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3′磷酸基团的单核苷酸的5′羟基转移。它是一种多聚核苷酸5′-OH激酶，对其他NTP也可产生相同的反应：
上面的磷酸化反应是可逆的，当反应体系没有ATP而只有ADP存在的情况下，T4多聚核苷酸激酶可以显示出5′磷酸酯酶的活性，催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3′磷酸基团的单核苷酸的5′磷酸基团转移到ADP，从而形成ATP。对其他NTP也可产生相同的反应：
基因工程实验中，常用到T4多聚核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5′-OH。这一反应可用来将核酸分子的5′-OH末端进行磷酸化，或用于标记核酸分子的5′端，制备寡核苷酸探针。
1.5′-OH末端磷酸化
在使用一些高保真的DNA聚合酶（如Pfu DNA聚合酶）通过PCR反应克隆获得一个DNA片段时，需要用到T4多聚核苷酸激酶将此DNA片段5′-OH末端进行磷酸化，才能将此DNA片段连接到载体上。实验中，一般在进行T4多聚核苷酸激酶反应之后进行连接反应。在这种情况下，T4多聚核苷酸激酶反应在反应缓冲液中进行37℃温育30 min即可。经过激酶处理的DNA片段不需要热失活，可直接进行连接反应。但是，如果连接反应中需要保持其他DNA片段的去磷酸化状态，则需要在连接反应前将T4多聚核苷酸激酶进行热失活。
T4多聚核苷酸激酶对5′平末端或5′凹陷末端的磷酸化效率相对于突出末端弱一些。要提高这两种类型5′末端的磷酸化效率，可在加T4多聚核苷酸激酶前，先在70℃将DNA样品加热5 min，然后放冰上冷却，或者加入5%（质量体积分数）的PEG-8000。经过这样的处理后再进行T4多聚核苷酸激酶处理，可适当提高磷酸化效率。
2.核酸分子5′端的标记
使用T4多聚核苷酸激酶对核酸分子的5′-OH末端进行标记也是常用的实验方法。进行放射性标记反应的一般方法是：50μL反应体系中，加入1×T4多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50 pmol的γ-［32 p］ATP和20U的T4多聚核苷酸激酶，于30℃温育30 min可催化1～50 pmol的5′末端发生磷酸化。［33 p］ATP可代替［32 p］ATP来进行标记反应。