人工合成的寡核苷酸探针

采用人工合成的寡核苷酸片段作为分子杂交的探针，优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响；由于大多数寡核苷酸探针长度只有15～30 bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度（T m），因此它特别适合基因点突变分析；此外，由于序列的复杂性降低，因此杂交所需时间也较短。需要注意的是，短寡核苷酸探针所带的标记物，特别是非放射性标记较少时，其灵敏度较低，因此当它被用于单拷贝基因的Southern印迹杂交时，采用较长的探针为好。

寡核苷酸探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成的。寡核苷酸探针的长度一般为10～50个核苷酸。如果靶DNA或靶mRNA的序列是已知的，合成寡核苷酸的序列就很容易确定。如果仅仅知道氨基酸的序列，由于遗传密码的兼并性，一个氨基酸兼有几个密码子编码，如以氨基酸顺序推测核苷酸顺序，则可能与天然基因不完全一致，因此探针的设计就复杂得多。在确定寡核苷酸序列时，一定要使该探针与靶基因序列特异性结合，而与无关序列不产生杂交反应。目前有专门的计算机软件帮助设计合成寡核苷酸探针，标记寡核苷酸探针常用的方法有5′末端标记法、3′末端标记法或引物延伸法。