六、反转录PCR

反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是一种将RNA的反转录和cDNA的PCR相结合的技术，它首先利用反转录酶将RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应扩增靶DNA。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量；可检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板；可以直接克隆特定基因的cDNA序列。

RT-PCR包括两个步骤：第一，RNA反转录酶合成互补cDNA第一链；第二，以cDNA为模板进行PCR反应扩增目的DNA。

根据反转录和PCR是否独立进行，可将RT-PCR分为一步法和两步法。一步法就是利用同一种反应缓冲液，在同一反应体系中加入反转录酶、引物、Taq DNA聚合酶、4种dNTP，先进行mRNA反转录再进行PCR反应，整个过程可以利用PCR仪来自动完成。反转录和PCR反应之间无须开管，操作简便，污染的可能性减小。此外，由于得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增，因此一步法的灵敏度更高。两步法则是将反转录和PCR分别在不同的缓冲液和不同反应体系中进行，首先进行mRNA反转录，再进行PCR。

一步法由于是在同一反应体系进行反转录和PCR，两个反应都不能选择酶反应的最佳条件，且容易相互干扰，因此通常只适用于基因特异引物来扩增较短的基因及定量PCR。两步法则由于反转录和PCR分别进行，两个反应都能选择酶反应的最佳条件，可充分发挥各自的特点，因此方法更为灵活而且严谨，适用于（G+C）%含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。

一步法在同一反应体系以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增，从而使mRNA的反转录PCR步骤更为简化，所需样品量减少到最低限度，对临床小样品的检测非常有利。用一步法可检测出总RNA＜1 ng的低丰度mRNA，因此可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq DNA聚合酶的测序技术相结合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。Tth DNA聚合酶不仅具有耐热DNA聚合酶的作用，而且具有反转录酶活性，可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。