三、RNA探针

mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，其优点是：①RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA杂交体的稳定性高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行（杂交温度可提高100℃左右），杂交的特异性更高；②单链RNA分子不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸序列杂交的效率较高；③RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少；④杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。但是，大多数mRNA中存在多聚腺苷酸尾，有时会影响其杂交的特异性，此缺点可以通过在杂交液中加入Poly（A），将待测核酸序列中可能存在的Poly（dT）或Poly（U）封闭而加以克服。另外，RNA极易被环境中大量存在的核酸酶降解，因此不易操作也是限制其广泛应用的重要原因之一。事实上，极少使用真正的mRNA作为探针，是因为其来源极不方便——一般是通过cDNA克隆，甚至基因克隆经体外转录而得到mRNA样或anti-mRNA样探针。

制备RNA探针的方法是：首先把目的基因cDNA片段插入含有特异的RNA聚合酶启动子序列的质粒中，再将重组质粒扩增、纯化，用限制酶将质粒模板切割，使之线性化，然后在RNA酶的作用下，从启动子部位开始，以cDNA为模板进行体外转录。在体外转录反应体系中，只要提供有标记的核苷酸原料，经过体外转录后就能获得标记的RNA探针。