重组子导入大肠杆菌
重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞有转化、转染和感染等不同手段，采用哪种方式要根据实验的目的和载体的类型来选择。
1.大肠杆菌的转化
（1）感受态与感受态细胞
细菌的自然转化是指一种细菌菌株捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称为受体菌株。但是，在自然界中转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式，不是所有细菌都能进行自然转化，细菌也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力，细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态被称为感受态。细菌的自然转化不能满足基因工程的需要，通过物理或化学处理可提高细菌吸收DNA的能力。
基因工程的转化也称人工转化，是指通过人工诱导大肠杆菌出现感受态，把质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入大肠杆菌细胞的过程。在基因的分子操作中，把经过物理或化学处理，处于容易吸收外源DNA状态的大肠杆菌细胞称为感受态细胞。感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合，这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的。
一般用于DNA分子操作转化受体细胞的大肠杆菌菌株应当具备两个基本条件：第一，属于安全宿主菌；第二，具有限制酶和重组酶缺陷。
（2）感受态细胞制备的方法
目前大肠杆菌常用的感受态细胞制备方法主要有DMSO休克感受态法和离子感受态法，离子感受态法主要有CaCl2和RbCl（KCl）法。RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，也称为超级感受态法，其转化率最高可达107～109转化子/μg质粒DNA，但制备较复杂，成本较高。CaCl2法制备感受态细胞，简便易行，其转化率为103～105转化子/μg质粒DNA，完全可以满足一般实验的要求。制备好的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-80℃保存一年，但是转化率会随着保存时间延长而降低。DMSO休克感受态法制备的感受态细胞转化率高，成本较RbCl法低，但是保存时间较短（于-80℃保存一个月），转化率就会降低超过一半，所以较少使用。
CaCl2转化的原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，溶液中的Ca2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用。0℃时转化混合物中的DNA会形成一种抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物；接着将转化混合物放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型（如抗Amp）的表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，30℃培养8～12 h得到的菌落都是含有质粒的，这种含有质粒的菌落也叫转化子。
在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态。对于绝大多数来源于大肠杆菌K12系列的hsdR—，hsdM—缺失衍生菌株（hsdR是一型限制酶；hsdM属于DNA甲基化酶，是一型限制酶的一部分），1μg的质粒DNA转化可以达到107～108个转化子。
（3）影响转化率的因素
大肠杆菌的转化率受到转化质粒DNA的浓度、纯度和构型，转化细胞的生理状态，经CaCl2处理后的成活率，温度、酸碱度、离子浓度等转化条件的影响。所以为了提高大肠杆菌的转化率，要考虑以下4个方面的因素。
第一，制备的感受态细胞的生长状态和密度。
不要用经过多次转接或保存于4℃的培养菌来作感受态细胞，最好从-80℃甘油保存的菌种中划线接种LB平板，挑取生长快速的单菌落于LB液体培养基中培养，至A600为0.5～0.6时，再划线接种LB平板，选择生长快速的单菌落用于制备感受态细胞。用于制备感受态细胞的菌液，其细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的A600来控制。如DH5α菌株的A600为0.5～0.6时，细胞密度约为5×107个/mL（不同的菌株情况有所不同），这时细胞密度比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。
第二，转化DNA的质量和浓度。
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的DNA，转化效率与源DNA的浓度在一定范围内成正比，当加入的DNA量过多或体积过大时，转化效率就会降低，1 ng的超螺旋态的质粒DNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和，一般情况下，加入DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10%，加入过多的DNA会降低转化率。开环质粒DNA或者质粒和外源DNA片段的连接产物，其转化率会远低于超螺旋质粒DNA。此外，重组质粒的相对分子质量也会影响转化率，相对分子质量超过15 kb的质粒转化率就更低了。
第三，制备感受态细胞的试剂的质量。
制备感受态细胞所用到的试剂的质量包括配制试剂的水的纯度，都会影响到感受态细胞的转化率。试剂（如CaCl2等）均须是最高纯度的（GR或AR），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。另外，制备感受态细胞所用容器的清洁度是很容易被忽略的，三角瓶和离心管等用品残留的痕量洗涤剂成分都会降低感受态细胞的转化率，所以容器最好用纯净水浸泡过夜，洗干净再用。
第四，防止杂菌和杂DNA的污染。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、吸头等最好是新的，并经高压蒸汽灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNase或杂DNA污染，否则均会影响转化效率或引起杂DNA的转入，给之后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
（4）转化基本步骤
大肠杆菌转化的基本步骤：将连接产物加入感受态细胞液中，轻轻混匀；置于冰上20 min；42℃热激45～60 s；再冰上放置2min；加SOC培养45～60min；取适量涂布到含有抗生素的LB平板上。如果转化产物是超螺旋的质粒DNA，则可以减少SOC培养45～60 min的时间，或者省略这一步骤。
2.大肠杆菌的电穿孔转化
电穿孔转化也称电转化，是受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收的过程。该方法可以转化相对分子质量较大的质粒，适用于所有的细菌，也可用于真核生物的转染。
电转化也适用于大肠杆菌，其基本原理是把细胞放在一种带有电极的杯子（称为电击杯）中，然后利用电脉冲仪的高压脉冲电场的作用，使大肠杆菌细胞产生瞬间的穿孔，这个穿孔足够大并可维持足够的时间，使外源DNA进入细胞。电转化法的转化效率比钙转化法高2～3个数量级，可以很容易达到109转化子/μg质粒DNA。转化率受到脉冲电场强度、脉冲时间和DNA浓度的影响。在做电转化时应注意以下事项：
①制备电转化用的感受态细胞必须用离子强度低的缓冲液，如培养至对数期的细胞用甘油或者山梨醇的10%溶液洗涤两次就可以用于电转化，也可以分装保存于-80℃。
②连接产物的反应体系是含有离子的缓冲液，因此添加太多的连接产物，会使转化产物的离子强度增加，引起电转化电流过大，导致发热量瞬间增大，细胞致死率增大，从而导致转化率降低或转化失败；转化产物的离子强度较大也容易导致电击杯被击穿。
③电转化感受态细胞浓度太高、太黏稠，或者加样不均匀，容易导致电击过程产生砰的一声“爆炸”；感受态浓度太稀则会导致无电转效果。
电击杯为塑料制成，上铸有嵌入式铝电极，一般商品化的电击杯采用伽马射线照射无菌处理过的无菌包装，一般建议一次性使用，如果要重复使用只能用75%酒精来消毒，避免损坏铝电极，但是被电击击穿的电击杯不能重复使用。电击杯一般有1，2，4 mm三种电极间距的规格，大肠杆菌转化一般采用1，2 mm的规格。
电击前将电击杯放入-20℃冰箱内待用，所有操作过程都要尽量在冰上进行，并放置足够的时间。由于电击杯电极间小，电击后的转化液无法用移液器吸出，也不能直接倒出，需用毛细管轻吸出来。
3.大肠杆菌的转染和转导
转染是指转化感染，凡是以噬菌体（如λ噬菌体和M13等）或病毒为载体，以转化的方法将DNA导入细胞的方法均称为转染，因此转染就方法来说与转化是一样的。但是在基因工程实验中，采用λ噬菌体直接转染大肠杆菌细胞的转化率很低，无法满足对转化率要求很高的基因操作（如基因文库构建）的要求。而转导是通过λ噬菌体颗粒感染细胞的途径把载体导入受体细胞的过程。基因工程的转导是指在体外模拟λ噬菌体DNA分子在受体细胞内的包装反应，将重组的λ噬菌体DNA或重组的柯斯载体DNA在体外包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒，然后通过感染大肠杆菌的方式导入大肠杆菌细胞的技术。
在操作过程中将重组的λ噬菌体DNA与λ噬菌体包装蛋白抽提物混合一段时间，即可进行平板涂布，混合物还可以保存一段时间。λ噬菌体包装蛋白抽提物可以自行制备，也可以购买商品的，它的效价是决定转化率的关键因素。商品化的λ噬菌体包装蛋白抽提物使用简便，效价高，但运输和保藏过程中可能导致其效价下降。