大规模DNA测序的基因克隆

传统的DNA测序的基因克隆流程是：构建基因组文库；分别进行基因文库筛选和亚克隆；测定亚克隆的序列；通过排列分析，获得目的DNA的全序列。但由于用于测序的克隆是随机挑选出来的，因此某些区段往往被重复测定，有时需要很长时间才能确定最后几个亚克隆的序列并拼出全序列。此外，这种测序法适用于基因文库有表型筛选的或者有标记的基因克隆，对于无表型和无标记的基因克隆，就犹如大海捞针了。此外，也可以利用随机测序克隆基因，即通过构建基因组的质粒文库，然后随机挑取克隆子进行测序分析，获得的序列再进行同源比对分析，初步分析其可能的基因功能，然后再进行实验验证所获得的序列的功能。这种方法获得的基因是随机的，无预期目的，而且只适于基因组较小的原核微生物的基因克隆。如果克隆预期的目的基因序列占整个基因组的比例很低，即使通过增加测序的样品，随机测序克隆基因法也很难保证能达到预期。

随着DNA高通量测序技术的发展和应用，微生物特别是原核微生物基因组（因其相对分子质量较小，组结构简单）采用基因组测序法对其目的基因的克隆已经变得非常简便了。但是，对于大多数高等生物来说，其基因组的相对分子质量庞大，而且结构复杂，拥有大量的重复序列，基因组测序不仅花费巨大，而且拼接工作也十分困难。大规模测序虽然能获得更多的序列，但不是一般实验室能做到的。所以转座子标签法、T-DNA标签法、图位克隆法和染色体步移技术等仍然是克隆未知目的基因的有效手段。