PCR产物的构建策略

PCR产物可以利用Klenow大片段酶或T4 DNA聚合酶将PCR产物变成平末端，然后采用平末端连接与载体连接，但其连接效率较低，所以PCR产物更多采用黏性末端连接与载体进行连接。根据PCR产物的特性可采用以下几种连接策略。

1.在PCR引物5′端引入酶切位点

在引物设计上，在5′端中增加相应的酶切位点和1～3个保护碱基。保护碱基的数目根据内切酶的种类不同和末端碱基数对酶切的影响不同来确定，不提倡添加过多的保护碱基，因为太多的额外碱基会增加PCR扩增的难度，同时增加合成费用。利用5′端带有酶切位点的引物进行PCR扩增，将PCR产物用对应的内切酶消化，使插入片段的末端变成黏性末端，这样就可以和带有同样黏性的载体进行连接（图10-1）。如果在上下游引物引入不同的酶切位点，就可以使PCR获得的目的片段定向插入载体。

2.利用PCR引物直接引入酶切位点

图10-1　利用PCR引物5′端引入酶切位点的方法

如果载体上酶切位点受限制而必须使用该酶切位点，而插入片段的序列又含有这种内切酶的识别位点，也没有同尾酶可以选择，这时就不能采用在引物5′端上添加酶切位点的方法来使插入片段末端变成该内切酶的黏性末端。这是因为插入片段中含有这种内切酶的识别位点，当用内切酶处理PCR产物时，同时也会把目的片段切断，连接反应中较短的片段会优先和载体连接，导致重组子只是含有小部分的插入片段，而得不到完整的插入片段。这时可以通过设计两套引物分别进行PCR，然后将两个PCR产物纯化后，充分变性再复性，这样混合物中就会有1/4是具有相应内切酶的黏性末端。如图10-2中，通过设计两对引物分别进行PCR反应，两个PCR产物经过变性再复性，混合物的产物4末端就变成EcoRⅠ和BamHⅠ的黏性末端，如此就能和用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切处理过的载体进行黏性末端连接。

图10-2　利用PCR引物直接引入酶切位点