PCR反应的特异性

五、PCR反应的特异性

PCR反应特异性（specificity）是指PCR反应的产物只产生预期的靶序列，不含非目标靶序列的DNA片段。理想的PCR反应除了忠实性高，还应该体现为高度特异性和高效性，高效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。要提高PCR反应的特异性可从以下几方面入手。

1.引物设计

保证引物长度适当（一般为18～24 bp），并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性。长度大于24 bp的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量。引物的浓度会影响特异性，最佳的引物浓度一般为0.1～0.5μmol/L，较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

2.提高退火温度

PCR的退火温度设定一般由引物的T m 决定，退火温度一般设定为比引物的T m 低5℃。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。因此，需要找到这个温度的均衡点。采用梯度PCR仪可以对PCR反应的退火温度进行优化筛选，确定特异性最好的退火温度。

3.合适的Mg2+浓度

较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性，为了确定最佳浓度，可以将Mg2+浓度从1 mmol/L到3 mmol/L，以0.5 mmol/L递增，进行最适Mg2+浓度的测定。

4.添加PCR辅助剂

甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂，其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，但是增强剂浓度要适当，否则会降低PCR的产量。

5.改进PCR策略

通过改进PCR策略，如采用热启动PCR、巢式PCR、降落PCR等提高PCR特异性。