第四节　酵母载体

基因的体外重组和表达体系起始于大肠杆菌，随着对真核基因表达和调控研究的深入，科学家发现酵母是研究真核生物DNA的复制、重组、基因表达及调控等过程的理想材料。在基因克隆实验中，酵母是真核生物常用的受体细胞。在酿酒酵母的大部分品系中都发现了质粒的存在，即2μm质粒，它是所有真核生物染色体外遗传因子研究得最多、最深入的一种质粒。该质粒是一闭合环状双链DNA分子，长度为2μm，分子大小约为6 300 bp，通常与蛋白质结合构成复合物，含有自主复制起始区和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定，每个细胞有20～80个质粒拷贝。在选择标记上，一般利用酵母的正常编码合成氨基酸的酶的基因。如Leu2基因编码β-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用Leu氨基酸作为选择标记，还需用到一种特殊的宿主，即Leu2营养缺陷体，它只有在添加亮氨酸的条件下才能正常生长。质粒中含有Leu2合成基因，可以在基本培养基上生长。

目前，人们已构建了许多酵母质粒载体，根据质粒的复制方式不同，把它们分为整合型载体（yeast integrative plasmid vector，YIp）、复制型载体（yeast replicating plasmid vector，YRp）、着丝粒型载体（yeast centromere-containing plasmid vector或yeast centromere plasmid vector，YCp）、附加体型载体（又称游离型质粒，yeast episomal plasmid vector或yeastextrachromosomal plasmid vector，YEp）等。以上几种类型的载体，它们共同的特点是：①能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增。②含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu2+、His+、URA3+、Trp+等；有些还携带用于大肠杆菌的抗生素抗性标记。③含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。酵母经过处理后，也像大肠杆菌一样能够接受外源重组体的导入。酵母的转化过程一般是先用酶消化细胞壁形成原生质体，经氯化钙和聚乙二醇（PEG）处理，使质粒DNA进入细胞，然后在允许细胞壁再生的选择培养基中培养。