提高连接效率的策略
1.载体的酶切效率
在基因重组中用到的载体类型很多，载体的相对分子质量、提取和纯化的方法都有不同。λ噬菌体等相对分子质量较大的载体，其提取难度比质粒载体大，对于高拷贝数的质粒，用小量碱裂解提取就可以满足一般的基因操作。现在已经有很多商品化的试剂可以快速获得高质量的载体DNA，完全可以满足基因重组的需要。
根据需要连入载体的位点，选择对应的限制性内切酶消化载体，使载体上产生一个缺口用于插入外源片段。选择限制性内切酶时要考虑酶的星号活力、甲基化、末端的特性等；为了考虑载体的酶切效率，通常会选择一些酶切效率高的酶，如BamHⅠ和EcoRⅠ等。如果要采用双酶切，还要考虑两个酶的最适反应温度和缓冲液等因素对酶切效率的影响。最适反应温度差距较大的，可以分步反应，先进行低温反应，再进行高温反应；如果不能找到一种缓冲液让两个酶保持高的活力，那就要先进行第一个酶的酶切反应，然后进行回收纯化，再进行第二个酶的酶切反应。酶切完毕要进行灭活，大多数内切酶可以采用高温灭活，有些耐高温的内切酶（如Taq DNA聚合酶Ⅰ）不能用高温灭活，需要用试剂盒进行回收纯化后才能进行连接反应。
经过酶切的载体需要经过纯化才能保证得到较高重组率，单酶切的载体还需要经过去磷酸化处理以防止载体自身环化。纯化的方法一般是选择琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，这样可以保证没有被酶切的质粒和切下的小片段与线性质粒分离，提高载体的重组率。回收的载体先进行一次不加外源DNA片段的连接反应，然后转化大肠杆菌感受态细胞，检验制备载体的自身环化率，合格后才和目的片段进行连接。
2.载体和插入片段的质量和纯度
连接相对分子质量较小的片段，纯度问题很容易被忽略，但是连接较大的片段或者是需要很高的重组率时，保证载体和插入片段的质量和纯度就十分重要了。实验发现，把1～3 kb的目的片段连接到质粒上是很容易的事情，而要把大于8 kb的片段连接到载体上就十分困难了；PCR产物的电泳条带清晰时，产物就容易连接，电泳条带不够清晰，甚至模糊时，连接就变得十分困难。
琼脂糖凝胶电泳回收目的片段中使用的琼脂糖的质量，质粒提取、胶回收和PCR产物试剂盒的质量，PCR试剂的质量和PCR产物的质量等，都有可能影响载体和插入片段制备的纯度和质量，从而影响连接效率。此外，EDTA、杂蛋白质和存留有活性的酶等影响酶切的因素也会影响连接效率。
3.连接反应条件优化
连接反应体系中的组成，如酶的用量、辅助物、载体和插入片段的比率等都会对连接效率产生影响。载体不同，插入片段的长度则会有不同的比率，可以借鉴相关的经验，如果是采用试剂盒则可以按说明书进行。
对于一般的连接体系，10μL的反应体系中载体和片段的浓度一般为20～100 ng，载体和插入片段的摩尔数为1∶3～1∶2，过低会降低重组率，过高容易导致多拷贝插入。
在反应体系中添加低浓度的PEG，可以有效地提高连接效率，所以有些公司的连接酶会附带PEG，或提供两种连接酶缓冲液，其中一种添加有PEG。注意添加有PEG的缓冲液会有悬浮状物质，需摇匀后再使用。
提高插入DNA的浓度、加入DNA载体、提高连接酶的用量、降低ATP的浓度和延长连接时间等都可以提高平末端连接的连接效率。平末端DNA连接所需的酶量比黏性末端连接所需的酶量至少多10～20倍，才能达到与黏性末端同样的连接效率。
虽然连接酶的最适反应温度为30℃，但在这一温度下黏性末端的氢键结合不稳定，反而导致连接效果差，因此连接反应的温度通常采用4～16℃，多选用12～16℃反应30 min～16 h（可以分段进行，如先低温处理再高温处理）。