PCR系统的基本要素
1.PCR程序
PCR反应必须具备温度循环参数，包括变性、复性和延伸的温度、时间及循环次数，这一系列参数组成就称为PCR程序。
一个标准的PCR程序设置包括高温（94～98℃）预变性2～10 min；高温（94～98℃）变性10～30 s，低温（40～65℃）退火30 s～1 min，适温（68～72℃）延伸1～5 min，进行25～40次循环；然后在适温（68～72℃）充分延伸3～10 min；最后4～16℃保存。
①变性温度和时间。由酶的特性和模板的性质来确定，（G+C）%含量高的可使用较高的变性温度和较长的变性时间。退火温度由引物的退火温度T m 来决定，一般低于5℃，退火温度高，特异性高。退火时间一般为30 s，对于退火温度较低的引物，如随机引物，可以延长退火时间。延伸温度一般为72℃，时间取决于DNA聚合酶的特性，Pfu DNA聚合酶的延伸时间较长，对于Taq DNA聚合酶一般约40 s延伸1 kb，存在复杂二级结构时应延长延伸时间。循环次数一般为25～35次，可以根据模板的目标DNA拷贝数来确定循环数，但对保真度要求较高的，一般尽量减少循环数。
②延伸时间。充分延伸的时间一般3～10 min，片段大，延伸时间较长，对于需要对PCR产物进行A-T克隆的，充分延伸的时间要10 min以上。
③保存时间。如果保存时间较短，可以设置为4℃保存，如果较长时间地保存最好设置为16℃，以免PCR仪长时间处于制冷状态，吸取空气的水分引起机器潮湿。
2.PCR体系
PCR除了需要具备一定的PCR程序外，还要具有一定的PCR反应体系，一个标准的PCR反应体系包括：模板、引物、核苷酸单体、耐热DNA聚合酶和反应缓冲液五个基本要素。
①模板。PCR模板就是含有所需扩增片段的目的DNA，单链或双链DNA都可以作为PCR的模板。在100μL的反应体系中，模板DNA的量一般为0.1～2μg，具体要根据目标DNA在总模板DNA中的拷贝数来确定，或者是根据模板DNA的复杂度来决定。不同模板DNA目标的拷贝数不同，复杂度高的模板DNA需要的模板量大。
②引物。PCR技术中，引物本质上是一小段单链DNA，作为DNA复制开始时DNA聚合酶的结合位点，DNA聚合酶只有与引物结合才可以开始复制。引物通过和模板DNA上的特定序列结合，决定PCR扩增的上游和下游位置。常规的PCR使用的引物浓度一般为0.01～0.5μmol/L。
③核苷酸单体（dNTP）。dNTP是合成DNA的底物，一般使用终浓度为0.2 mmol/L（pH=7.0），4种dNTP的浓度应平衡。虽然dNTP使用终浓度为0.4 mmol/L有利于提高PCR产物的产量，但为了提高PCR的忠实性，使用时应考虑Mg2+、引物、产量之间的关系。如序列分析和制备探针时需要使用终浓度较低，为20～40μmol/L。
④耐热DNA聚合酶。其作用是合成DNA。使用最早和最广泛的是来源于Thermus aquticus的Taq DNA聚合酶，最适反应温度为75℃。目前商品化的PCR用酶有很多类型，可以根据自己的实验需要选择合适的酶。
⑤缓冲液。缓冲液用于维持PCR反应体系的稳定。一般的缓冲液配制成“10×”的保存缓冲液，也有“2.5×”或“5×”，不同厂家不同类型的耐热DNA聚合酶的缓冲液组成也不同，使用时要注意阅读产品说明书。缓冲液使用终浓度为“1×”，主要包含50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.3～9.0）和0.5～2.5mmol/LMgCl2，有些PCR的缓冲液还含有明胶和BSA。Tris-HCl缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，20mmol/L的Tris-HCl缓冲液在20℃时pH为8.3，在典型的热循环条件下，真正的pH为7.8～6.8。K+浓度在50mmol/L时能促进引物退火，但现在有研究表明，NaCl浓度在50 mmol/L时，KCl浓度高于50 mmol/L将会抑制Taq DNA聚合酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用，一般用量为100 pLg/mL，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好的PCR结果，影响不大。
3.PCR产物的积累
从理论上分析一个普通的PCR反应，其产物包含短产物片段和长产物片段两种类型。短产物片段是指与模板互补的两个引物5′端之间的DNA片段，即需要扩增的特定DNA片段；长产物片段是产物的3′端超出另一引物的5′端——原因在于引物所结合的模板不一样。以一个原始模板为例，在第一个循环的反应中，两个引物分别与两条互补的模板DNA链退火结合，并从引物的3′端开始延伸合成一条与模板DNA互补的新链；新链的5′端是固定的，而3′端则没有固定的终止点，其合成的新DNA链长度会超过另一个引物的5′端，这种产物就是长产物片段。进入第二循环后，引物除与原始模板退火结合外，还可同上一次循环新合成的链，即长产物片段结合，这时，由于新链模板的5′端序列是固定的，这就相当于这次延伸的片段3′端被固定了止点，所以保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出短产物片段是按指数倍数增加的，而长产物片段则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使PCR反应的产物在进行琼脂糖电泳时一般只看到短产物片段，也不需要再进行纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。以一个拷贝模板来计算，反应最终的DNA扩增量，即为
其中，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次的平均扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率X的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值，在PCR反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加。在PCR反应的后期，体系中底物dNTP和引物的浓度降低，酶的活力和稳定性降低，高浓度产物下，变性不彻底，焦磷酸末端产物抑制，非特异性竞争，当产物积累到一定的浓度（0.3～1 pmol/L）时，产物的积累按减弱的指数速率增长，最后进入线性增长期或静止期，即出现停滞效应，这种效应称为平台期。
PCR的扩增效率开始取决于影响DNA聚合酶活性的因素，随着PCR反应的进行，还会受到非特异性产物竞争等因素的影响，因此平台期的到来是不可避免的。虽然PCR平台期的出现是不可避免的，但是一般的PCR反应在平台期到来之前，目标DNA产物的积累已经能满足实验需要。若平台期过早到来，那么在一定程度上可以判断PCR的反应的条件不是最佳的，产物的特异性会降低。达到平台期所需要的循环数与PCR中模板、引物和DNA聚合酶的种类、活力、扩增效率，以及PCR扩增体系中其他非特异性的引物、污染的模板有关，各种有利于提高扩增特异性的因素，都可以延缓平台期的到来。