提高外源基因在酵母中的表达水平

外源基因表达水平的高低决定了它能否成为产品，对于医用蛋白的表达水平，要求相对较低，但对工业用蛋白的表达水平要求较高。

提高外源基因在酵母中的表达水平，有选择强的启动子来控制外源基因的转录水平、提高外源基因在宿主的拷贝数和提高外源基因表达的因素等措施。外源基因的表达量和转录水平有很大的关系，所以选择强的启动子对提高和控制外源基因的转录水平十分重要。常用的酵母启动子主要是与糖代谢相关的启动子，如3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子（GAP）、甘油激酶基因启动子（PGK）、酸性磷酸酶基因启动子（POH5）；以及与醇代谢相关的启动子，如醇氧化酶基因启动子（AOX，IVIOX）。

提高外源基因在宿主细胞内的拷贝数对基因表达水平有明显的影响，一般来说，拷贝高的表达量也高。提高外源基因在细胞内的拷贝数的方法之一就是利用酵母天然的内源多拷贝质粒。如酿酒酵母的2μm质粒和乳酸克鲁维酵母的pKDⅠ质粒，在细胞中可以达到60～100个拷贝以上，但是这种内源质粒连上外源基因后，在非选择性培养基会存在不稳定的现象，随着培养代数的增加，拷贝数减少，有时拷贝数会低于10个。

不是所有的酵母都有天然的内源多拷贝质粒，但是所有的酵母都有多拷贝重复序列，因此，这类酵母想获得多拷贝的重组子，可以利用染色体中的多拷贝重复序列进行整合而得。如大多数酵母都可以将rDNA序列作为整合位点，经过筛选获得拷贝数为60～100个以上的重组子，而且在非选择性培养基上也十分稳定。

此外，一些载体以染色体上的单拷贝的序列作为整合位点介导区，也可以筛选到稳定的多拷贝转化子。如在Pichia pastoris中以pPIC9K或pPIC3.5K作为载体，以his4或AOX1作为整合介导区，在G418的选择压力下，可以获得拷贝数超过100个的重组子。

外源基因在宿主中的表达是一个综合性的问题，为了提高外源基因在宿主内的表达水平，还要考虑翻译起始区前后的mRNA二级结构、密码子的偏好性、发酵条件的控制等因素对基因表达的影响。外源基因存在的A-T富含区容易产生一些酵母转录中断序列，如含有TTTTATA和ATTATTTTATAAA序列的外源基因在PPichia pastoris中容易发生转录提前终止现象，无法获得完整的mRNA；Kozak序列不合理的mRNA 5′端的二级结构会抑制翻译的起始；施加选择压力、优化发酵条件、提高培养细胞的密度和调节细胞的代谢负荷都能有效地提高酵母工程菌的表达量。